ANALYSIS OF OLIGONUCLEOTIDE IMPURITIES ON THE BIOACCORD LC-MS SYSTEM WITH ACQUITY PREMIER

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy představují moderní terapeutickou třídu s potřebou přesné kontroly kvality a charakterizace nečistot. Analýza stopových množství nečistot vyžaduje citlivé, reprodukovatelné a inertní chromatografické systémy, aby se předešlo adsorpci na kovové povrchy a ztrátám analytu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkon nového chromatografického systému BioAccord LC-MS s UPLC jednotkou ACQUITY Premier a kolonkou Premier OST, vybavenou MaxPeak HPS technologií, pro minimalizaci interakcí 21-mer oligonukleotidu a detekci jeho nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma: BioAccord LC-MS systém s ACQUITY Premier UPLC.
• Kolonky: Premier OST (2.1×100 mm, 1.7 µm BEH C18, P/N 186009485) vs. běžná OST kolona s kovovou obálkou (P/N 186003950).
• Mobilní fáze: A = 7 mM TEA + 40 mM HFIP ve vodě, B = 3,5 mM TEA + 20 mM HFIP v 50 % metanolu; gradient 25–35 % B/25 min, tok 300 µL/min, teplota 60 °C.
• Spektrometrie: negative ESI, m/z 400–5 000, skenovací frekvence 2 Hz, kapilární napětí 0,8 kV, kužel 40 V, teplota zdroje 120 °C, desolvatace 400 °C.
• Vzorek: 21-mer oligonukleotid s 19× 2’-OMe modifikacemi, 10 pmol na injekci.
• Informatika: waters_connect software, dekonvoluce BayesSpray.

Hlavní výsledky a diskuse

• Premier OST kolona díky inertnímu povrchu detekovala všech 14 nečistot, kdežto běžná kolona pouze sedm nejhojnějších.
• Chromatografické špičky byly ostré, dobře separované a vysoce opakovatelné bez nutnosti kovové pasivace.
• Dynamický rozsah měření pokrýval 0,5–1000 nM s lineárním koeficientem R² = 0,9999 a RSD < 15 %.
• Hmotnostní přesnost dekonvoluovaných mas lepší než 15 ppm i pro stopové nečistoty (0,18 % dle UV).
• Carry-over test ukázal nulovou detekci analytu v blank vzorku po injekci 10 pmol.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a přesnost pro identifikaci a kvantifikaci nečistot v oligonukleotidech.
• Možnost detekce 5 fmol oligonukleotidu.
• Kompatibilita s automatizovaným workflow a regulačními požadavky v QA/QC laboratořích.
• Současný sběr LC-UV a LC-MS dat pro komplexní charakterizaci vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření inertních povrchových technologií na analýzu peptidů a proteinů.
• Integrace pokročilých datových algoritmů pro automatizovanou detekci nízkoabundantních modifikací.
• Zkrácení analýz pomocí rychlejších gradientů a menších objemů mobilních fází.
• Implementace do klinických laboratoří pro monitorování biofarmaceutik.

Závěr

Systém BioAccord LC-MS s ACQUITY Premier UPLC a Premier OST kolonou významně zlepšuje separaci, detekci a kvantifikaci oligonukleotidových nečistot díky inertním povrchům a optimalizovanému workflow. Metoda splňuje náročné požadavky farmaceutického výzkumu na citlivost, opakovatelnost a hmotnostní přesnost.

Reference

1. DeLano M, Walter TH, Lauber MA et al. Anal Chem. 2021;93:5773–5781.
2. Gilar M, DeLano M, Gritti F. J Chrom A. 2021;1650:462247.
3. Sharma VK, Watts JK. Future Med Chem. 2015;7(16):2221–2242.