ANALYSIS OF OLIGONUCLEOTIDE IMPURITIES ON AN UHPLC-TOF MS SYSTEM WITH A MODIFIED SURFACE TECHNOLOGY

Význam tématu

Oligonukleotidová terapie představuje perspektivní přístup k léčbě na základě cílené modulace genové exprese. Pro výrobu a kontrolu kvality těchto makromolekul jsou nezbytné vysoce selektivní a citlivé LC/MS metody, které umožní spolehlivou identifikaci a kvantifikaci nečistot. Konvenční UHPLC systémy však trpí ztrátami analytu a špatnými tvarovými vlastnostmi píků kvůli interakcím s kovovými povrchy fluidiky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost platformy BioAccord LC-MS vybavené ACQUITY Premier technologií a modifikovanými OST kolonami s MaxPeak HPS povrchy při analýze 21-mer oligonukleotidu s nízkoúrovňovými nečistotami. Hodnoceny byly chromatografické vlastnosti, detekční limity, linearita kalibrace a přesnost hmotnostního měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• IP-RP UHPLC separace na C18 kolonách 2,1×100 mm (OST vs. konvenční) s gradientem 25–35 % B za 25 min při 60 °C.
• Mobilní fáze A: 7 mM TEA a 40 mM HFIP ve vodě; fáze B: 3,5 mM TEA a 20 mM HFIP v 50% methanolu.
• Průtok 0,3 ml/min, injekce 10 μl.
• ESI TOF MS v negativním módu, m/z 400–5000, scan 1 s.

Instrumentace:

• BioAccord LC-MS systém s ACQUITY Premier UPLC BSM technologií.
• ACQUITY Premier OST kolony s MaxPeak HPS modifikovanými povrchy.
• Software waters_connect pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Nová koncepce povrchů prokázala výrazné zlepšení:

• Optimalizovaný tvar píků a stabilní signál oproti konvenční koloně.
• Minimální nespecifická adsorpce a nulový carryover při 1000 nM injekci.
• Lineární kalibrace v rozsahu 0,5–1000 nM (R² > 0,999) a hmotnostní přesnost <15 ppm.
• Identifikace 14 nečistot s relativním zastoupením až 0,2 %.

Přínosy a praktické využití

Kombinace modifikovaných povrchů MaxPeak HPS a ACQUITY Premier OST kolony poskytuje robustní analytickou platformu pro rutinní QC oligonukleotidů. Systém umožňuje nízké meze detekce, vysokou reprodukovatelnost chromatografie a spolehlivou hmotnostní verifikaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k automatizaci přípravy vzorků, integraci s vysoce rozlišovacím MS, aplikacím na modifikované či konjugované oligonukleotidy a dalším farmaceutickým i biotechnologickým oblastem.

Závěr

Implementace MaxPeak HPS povrchů v UHPLC fluidice a ACQUITY Premier OST kolonkách významně zlepšuje analýzu oligonukleotidových nečistot. Metoda splňuje požadavky náročné QC praxe z hlediska citlivosti, přesnosti i reproducibility.

Reference

• Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress, Future Med Chem, 2015, 7(16): 2221–2242.
• DeLano M, Walter T, Lauber M, Gilar M, Jung MC, Nguyen JJ, Boissel CC, Patel AV, Wyndham Bates-Harrison K. Mitigate analyte interactions with metal surfaces in UHPLC, Anal Chem, 2021, 93: 5773–5781.
• Doneanu C, Knowles CK, Fox J, Yu YQ, Fredette J, Chen W. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier, Application note 720007301, Waters, 2021.