Fast and Efficient Peptide Mapping of a Monoclonal Antibody (mAb): UHPLC Performance with Superficially Porous Particles

Význam tématu

Peptidové mapování je zásadní technika pro detailní charakterizaci bioterapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek. Umožňuje identifikovat proteiny, varianty sekvencí a post-translační modifikace s vysokou přesností. Rychlé a spolehlivé mapování hraje klíčovou roli při vývoji, kontrole kvality a registraci nových biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnost sloupce AdvanceBio Peptide Mapping (2,7 µm, superficially porous particles) provádět vysokorozlišovací peptidové mapy mAb během velmi krátkých analýz (< 15 min) při tlacích běžných HPLC systémů (< 450 bar). Výsledky byly porovnány s tradičními sub-2 µm UHPLC kolónami za účelem ověření kvality separace, citlivosti a sekvenčního pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku se denaturovala a redukovala mAb IgG1 (30 mg/mL) DTT, alkylovala IAM a trávení trypsinem probíhalo při 37 °C po 20 h. Digesty byly zastaveny formiovou kyselinou a naředěny pro analýzu.

Použitá instrumentace

• LC systém: Agilent 1290 Infinity
• Kolony: AdvanceBio Peptide Mapping 2,1 × 100 mm a 2,1 × 150 mm
• Eluenty: A – voda/0,1 % FA; B – 90 % ACN/0,1 % FA
• Detekce UV: 215/220 nm, teplota 40 °C, injekce 15 µL, průtok 0,2–0,6 mL/min
• MS: Agilent 6530 Q-TOF (positive mode, Dual Jet Stream, rozsah m/z 100–1600, MS scan 8 Hz, MS/MS scan 3 Hz)

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace gradientů: 75min separace (2,1 × 150 mm) poskytla 59 peptidů, 14min (2,1 × 100 mm) 57 peptidů při zachování baseline rozlišení.
• LC/MS porovnání: zkrácením gradientu z 40 min na 14 min se sekvenční pokrytí mAb snížilo jen minimálně z 99,84 % na 99,63 %, detekce PTM (deamidace Asn357) zůstala plně zachována.
• Komparace s UHPLC sloupcem: AdvanceBio kolóna při 433 bar dosáhla 56 chromatografických špiček; sub-2 µm UHPLC sloupec potřeboval 700 bar pro 52 špiček.
• LC/MS výsledky: AdvanceBio dosáhlo 76 peptidů s pokrytím 99,63 % sekvence, sub-2 µm UHPLC dosáhlo 99,0 % při vyšší tlakovém zatížení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje zkrátit dobu analýzy až čtyřikrát oproti tradičním protokolům, přičemž zachovává vysokou kvalitu separace a spolehlivou detekci PTM. Nízké provozní tlaky umožňují provoz na standardních HPLC systémech dostupných ve většině laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj superficially porous částic povede k dalšímu zkracování analýz a zvyšování rozlišovací schopnosti. Integrace s automatizovanými workflow a online bioreaktory umožní real-time monitoring proteinových produktů. Pokročilé datové algoritmy a umělá inteligence mohou dále zlepšit interpretaci komplexních peptidových map.

Závěr

AdvanceBio Peptide Mapping kolóna prokázala schopnost poskytovat rychlé, vysoce rozlišovací peptidové mapy mAb při tlacích běžných HPLC systémů. Výsledky jsou srovnatelné s nejvýkonnějšími UHPLC kolónami, ale bez nutnosti vysokotlakého vybavení, což zvyšuje praktickou použitelnost v rutinních laboratořích.