Enhancing The Quality Of Peptide Mapping Separation For The Analysis Of PTM

Význam tématu

Peptidové mapování je základní analytickou metodou v bioprodukci monoklonálních protilátek (mAb). Posttranslační modifikace (PTM), jako oxidace, deamidace či glykosylace, ovlivňují účinnost, stabilitu i bezpečnost biologických léčiv. Vysoká rozlišovací schopnost chromatografické separace ve spojení s hmotnostní spektrometrií (LC/MS) umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci těchto modifikací.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem této studie bylo ověřit schopnost Agilent AdvanceBio Peptide Plus sloupce zajistit vysoce efektivní a reprodukovatelné oddělení PTM obsahujících peptidů z tryptického digestu terapeutického trastuzumabu. Studie hodnotila:

• sekvenační pokrytí mAb peptidů,
• reprodukovatelnost chromatografických profilů,
• oddělení a kvantifikaci oxidačních, deamidovaných a glykosylovaných forem peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: Trastuzumab byl redukován DTT a alkylován IAA za denaturačních podmínek, následoval tryptický digest při poměru protein:trypsin 20:1 přes noc při 37 °C.
Chromatografie a MS detekce:

• Kolona: Agilent AdvanceBio Peptide Plus, 2.1×150 mm, 2.7 µm, 120 Å.
• LC systém: Agilent 1290 Infinity II (multisampler G7167B, high speed pump G7120A, multicolumn thermostat G7116B).
• Mobilní fáze: A – 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, B – 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu; gradient 3→40 % B za 31 minut, flow 0,5 mL/min, teplota 55 °C.
• MS systém: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF, pozitivní ionizace ESI, rozsahy MS 100–1700 m/z a MS/MS 50–1700 m/z, BioConfirm software B.08.00.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost: Pět po sobě jdoucích injekcí digestu ukázalo stabilní sekvenační pokrytí mezi 97,3–99,3 %.
Oxidace: Peptid DLTMISR byl rozdělen na nativní a oxidovanou formu s rozlišením umožňujícím spolehlivý výpočet 1,6 % relativní oxidace. MS/MS potvrdila +16 Da shift na metioninu.
Deamidace: Sloupec dokázal oddělit formy peptidu NTAYLQMNSLR deamidované na asparaginu i isoasparaginu. Relativní deamidace se pohybovala mezi 0,21–15,9 %.
Glykosylace: Glykopyptid EEEQYNSTR byl separován do forem bez glykany a s různými N-glykanovými strukturami (G0, G0F, G1F, G2F). Distribuce glykoform byla 6,1 % G0, 39 % G0F, 47 % G1F a 7,3 % G2F.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje vysoké obsahové pokrytí (>99 %), ostré a symetrické špičky peptidů a spolehlivou separaci PTM forem. To usnadňuje kvantitativní a kvalitativní kontrolu bioterapeutik v rámci vývoje a výroby, zajišťuje shodu kritických atributů kvality a zvyšuje důvěru v bezpečnost a účinnost léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší využití hybridních sloupců pro komplexní směsi peptidů, integrace se špičkovými hmotnostními spektrometry s vyšším rozlišením a citlivostí, automatizace přípravy vzorků a výpočetních nástrojů pro strojové učení. Rozvoj nových chemických modifikací povrchu stacionární fáze a optimalizace gradientů umožní detailní profilování vzácných PTM.

Závěr

Agilent AdvanceBio Peptide Plus kolona ve spojení s 1290 Infinity II LC a 6545XT Q-TOF MS prokázala vynikající rozlišovací schopnost a reprodukovatelnost při analýze peptidového mapování a PTM charakterizace mAb. Metoda nabízí robustní platformu pro pokročilý vývoj a kontrolu bioterapeutik.

Reference

1. Suresh Babu C. V. LC/MS analysis of peptide mapping with formic acid ion-pairing agent; Application note, Agilent Technologies, Inc. Publication number 5991-7979EN, 2017.