Peptide Mapping - Agilent BioHPLC Columns Application Compendium

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová metoda pro detailní identifikaci a charakterizaci proteinů v bioterapeutikách. Umožňuje potvrdit primární sekvenci, lokalizovat a kvantifikovat posttranslační modifikace (oxidace, deamidace, glykozylace) a monitorovat konzistenci výrobních procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem představených aplikací je demonstrovat rutinní workflow peptide mappingu bioterapeutik pomocí standardu Agilent-NISTmAb. Studie ukazují integraci automatizované přípravy vzorků, ultrarychlé UHPLC separace na sloupcích AdvanceBio Peptide Mapping a detekce hmotnostní spektrometrií (Q-TOF a single quadrupole). Výsledky jsou zpracovány automaticky v softwaru BioConfirm a OpenLab ChemStation.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorková příprava: Denaturace, redukce, alkylace a tryptická digesce, automatizace na platformě Agilent AssayMAP Bravo.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II UHPLC se ZORBAX RRHD C18 nebo AdvanceBio Peptide Mapping kolónami (120/300 Å, 1.8–2.7 μm, 2.1×150–250 mm).
• Detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (m/z 100–1 700) a Agilent InfinityLab LC/MSD XT single-quad (m/z 360–1 400) s Jet Stream ESI.
• Softwarové zpracování: MassHunter BioConfirm pro automatizované mapování sekvence, OpenLab ChemStation pro extrakci iontových chromatogramů (EIC), kvantifikaci a inteligentní reporting.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rychlá UHPLC separace (<20 min) generuje charakteristické „otisky“ >100 peptidů s vysokým rozlišením a reprodukovatelností.
• Sekvenční pokrytí NISTmAb až 99,4 % při 15min gradientu.
• Vynikající reprodukovatelnost: CV <3–4 % u 25 klíčových peptidů (n=64) včetně 200 injekcí bez zásadního posunu RT nebo plochy píku.
• Detekce PTM: lokalizovaná oxidace Met, deamidace Asn a glykozylace s přesností <5 ppm (Q-TOF) a sledování pomocí EIC (SQ).
• Efektivní kvantifikace glykozylovaných forem (G0F, G1F, G2F) potvrzuje konzistentní poměry s literárními daty.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované řešení zkracuje dobu přípravy a analýzy, minimalizuje lidské chyby a zvyšuje propustnost laboratoře. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality bioterapeutik i vývojové studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směřování k dalšímu rozšíření automatizace, robotizované přípravě vzorků, pokročilé bioinformatice a cloudovým řešením. Integrace strojového učení pro predikci stability a screening nových modifikací posílí efektivitu vývoje biologik.

Závěr

Kombinace automatizované přípravy na AssayMAP Bravo, rychlé UHPLC, MS detekce a pokročilého softwaru umožňuje transformovat komplexní peptide mapping do rutinní, vysoce reprodukovatelné a vysoce propustné metody pro analytiku bioterapeutik.

Reference

1. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies, publication number 5991-2957EN.
2. Fast and Efficient Peptide Mapping of a Monoclonal Antibody (mAb): UHPLC Performance with Superficially Porous Particles. Agilent Technologies, publication number 5991-3585EN.
3. High Resolution and Rapid Peptide Mapping of Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infinity UHPLC and an Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS System. Agilent Technologies, publication number 5991-3600EN.
4. Quantitation of Chemical-Induced Deamidation and Oxidation on Monoclonal Antibodies Using Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF and Agilent MassHunter BioConfirm Software. Agilent Technologies, publication number 5994-0406EN.
5. The NISTmAb Tryptic Peptide Spectral Library for Monoclonal Antibody Characterization. MAbs 2018, 10(3), 354–369.
6. In-Depth Characterization and Spectral Library Building of Glycopeptides in the Tryptic Digest of a Monoclonal Antibody Using 1D and 2D LC–MS/MS. J. Proteome Res. 2016, 15(5), 1472–1486.
7. Assessment of Chemical Modifications of Sites in the CDRs of Recombinant Antibodies: Susceptibility versus Functionality of Critical Quality Attributes. MAbs 2014, 6(2), 327–339.
8. OpenLab CDS ChemStation Edition with Content Management Systems User’s Guide. Agilent Technologies, publication number M8301-90089 Rev.B.
9. OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.09, Guide for Administrators. Agilent Technologies, publication number M8305-90019 Rev. B.
10. Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies, publication number 5991-4872EN.