High Resolution and Rapid Peptide Mapping of Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infi nity UHPLC and an Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS System

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová technika při charakterizaci terapeutických protilátek. Umožňuje detailní určení primární struktury, identifikaci posttranslačních modifikací a kontrolu kvality biologických léků. Díky kombinaci chromatografického a hmotnostního rozlišení přináší vysokou citlivost a specifitu v krátkém čase analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat rychlou a vysoce rozlišovací metodu peptidového mapování monoklonální protilátky IgG1 pomocí Agilent 1290 Infinity UHPLC spojeného s Agilent 6550 iFunnel Q-TOF hmotnostním spektrometrem. Autoři optimalizovali gradient, parametry LC/MS a prověřili pokrytí sekvence, citlivost detekce a identifikaci posttranslačních modifikací během 15minutové analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Sample prep: redukce DTT, alkylace iodoacetamidem, trávení trypsinem při 37 °C přes noc.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity LC System s AdvanceBio Peptide Mapping kolonkou (2,1×250 mm, 2,7 μm), teplota 60 °C, gradient 3–90 % acetonitrilu v pH 2, formiát 0,1 % během 15 min, průtok 0,5 ml/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6550 iFunnel Q-TOF s Dual JetStream zdrojem, pozitivní iontový režim, rozmezí m/z 300–1700, MS/MS 50–1700, skenovací rychlosti 8 a 3 spektra/s.
• Software: Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06 a BioConfirm B.06 pro automatickou extrakci, přiřazení sekvencí a detekci PTM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rychlý 15minutový gradient dosáhl 92,1% pokrytí sekvence IgG1 s identifikací 77 peptidů včetně glykozylace, oxidace a deamidace.
• Konvenční 60minutový gradient poskytl 95,1% pokrytí a 82 peptidů, avšak 15minutová metoda nabídla srovnatelnou kvalitu za čtyřnásobně kratší dobu.
• Příkladem je rozlišení izoasparaginu a asparaginu u peptidu A(48–63), kde MS/MS spektra prokázala přírůstek 0,98 Da a rozlišení izobarických forem.
• Automatizovaná výpočetní workflow umožnila rychlou extrakci všech izotopů a nabitých stavů, kvantifikaci modifikovaných forem (3,7 % a 13 %) a generování závěrečné zprávy.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy z 60 na 15 minut šetří laboratorní čas a náklady.
• Vysoké rozlišení a citlivost Q-TOF MS/MS podporuje detekci nízkoobsažných modifikací.
• Automatizovaný software zvyšuje reprodukovatelnost a usnadňuje validaci metod v QA/QC prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace nano-UHPLC systémů pro snížení spotřeby vzorku.
• Využití umělé inteligence a pokročilých algoritmů pro predikci a detekci dosud neznámých modifikací.
• Rozšíření aplikace na jiné biologické molekuly (enzymy, rekombinantní proteiny) a kompleksní proteomické studie.

Závěr

Představená metoda spojuje rychlý UHPLC gradient s vysoce citlivým Q-TOF MS/MS a nabízí robustní platformu pro komplexní peptidové mapování monoklonálních protilátek. Široké pokrytí sekvence i detailní identifikace PTM potvrzují její vhodnost pro rutinní i výzkumné využití.

Reference

1. Ning Tang, James Martosella, Alex Zhu (2013) High Resolution and Rapid Peptide Mapping of Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infinity UHPLC and an Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS System. Agilent Technologies Application Note 5991-3600EN.