AdvanceBio Peptide Mapping - An HPLC Column Technology for Faster Protein Biocharacterizations

Význam tématu

Peptidové mapování představuje nezbytnou techniku pro detailní charakterizaci bílkovin a monoklonálních protilátek. Umožňuje odhalit bodové mutace, špatné přepisování DNA, posttranslační modifikace a malé rozdíly, které by v rámci celé molekuly zůstaly skryté.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem představené technologie AdvanceBio Peptide Mapping Column je zkrátit dobu analýzy peptidů při zachování vysokého rozlišení a obsahu biocharakterizačních dat. Studie demonstruje porovnání parametrů, jako jsou kapacita píků, sekvenční pokrytí a tlakové nároky, na příkladech BSA a IgG tryptických digesát.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika je založena na chromatografii s povrchově pórovými C18 částicemi o velikosti 2,7 µm. Aplikovány byly gradientní eluce s mobilními fázemi A (0,1 % TFA ve vodě) a B (0,1 % TFA v acetonitrilu) při různých rychlostech a délkách kolony. Optimalizovány byly parametry jako doba běhu, strmost gradientu, teplota 30–65 °C a objem vzorku.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II HPLC
• Agilent 1260 Bio-Inert HPLC
• Agilent 1200 Series
• Agilent 6530 Q-TOF MS

Hlavní výsledky a diskuse

V porovnání s tradičním C18 kolonami (4,6×250 mm, 5 µm) se dobu analýzy podařilo snížit z 115 min na 14 min (2,1×100 mm), aniž by došlo ke ztrátě rozlišení. Sekvenční pokrytí IgG činilo až 99,63 %, kritické posttranslační modifikace (deamidace) byly plně zachovány. AdvanceBio kolony nabídly vyšší kapacitu píků i proti konkurentům s 3,6 µm a 1,7 µm částicemi při nižším provozním tlaku (433 bar vs. 680 bar). Prokázána byla vynikající reprodukovatelnost (RSD < 1 % RT) a stabilita povrchu při pH 2,2 po 200 injekcích či životnost až 5000 cyklů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá biocharakterizace terapeutických proteinů a protilátek
• Vysoká citlivost pro detekci PTM, glykozylací a bodových mutací
• Efektivní profilování peptidových nečistot a kvantitativní analýzy (např. melittin)
• Kompatibilita s LC/MS a běžnými kyselými jejím mobilními fázemi

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování analýz s udržením vysokého rozlišení, rozšíření fázových chemických modifikací pro širší škálu molekul a integrace s vysokorozlišovacími MS systémy. V budoucnu lze očekávat automatizované workflow pro paralelní multiplexní analýzy peptidů a adaptaci kolony pro vysoce citlivé kvantitativní metody.

Závěr

AdvanceBio Peptide Mapping Column kombinuje rychlou analýzu, vysokou účinnost separace a nižší tlakové nároky, čímž poskytuje vyvážené řešení pro detailní biocharakterizaci proteinů v laboratořích i na průmyslové úrovni.

Reference

• How-To Guide: Peptide Mapping, pub. č. 5991-2348EN
• Agilent Biocolumns Selection Guide
• Martosella et al., EPO glycoprotein mapping, pub. č. 5991-2085EN a 5991-1813EN
• IgG1 peptide mapping, pub. č. 5991-3585EN a in-print