High Resolution Glycopeptide Mapping of EPO Using an Agilent AdvanceBio Peptide Mapping Column

Význam tématu

Peptidové mapování kombinované s LC/MS je klíčovou technikou pro charakterizaci bioterapeutik, kde je nezbytná přesná identifikace sekvence, modifikovaných zbytků a glykozilačních míst. V případě rekombinantního lidského erytropoetinu (rhEPO) glykozylace zásadním způsobem ovlivňuje stabilitu a účinnost léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo demonstrovat vysokorozlišovací schopnosti Agilent AdvanceBio Peptide Mapping kolony (2.7 µm, 2.1×250 mm) při analyzování tryptického digestu rhEPO a optimalizovat chromatografické podmínky pro rychlé a citlivé glykopeptidové profilování.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Agilent 1200 Infinity LC systém s HiP-ALS autosamplerem, binárním pumpovacím modulem, tkolonovým termostatickým prostorem a DAD detektorem.
• Kolona: Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 2.1×250 mm, 2.7 µm, C18.
• Eluenty: A– voda + 0,1 % formamidové kyseliny; B– acetonitril + 0,1 % formamidové kyseliny.
• Gradient: 3 % B do 45 % B v 28 min, následně do 95 % B v 34 min, návrat a reequilibrace.
• Parametry MS: Agilent 6224 TOF LC/MS, pozitivní režim, rozsah 100–7000 m/z, Extended dynamic range (2 GHz), gas temp. 350 °C, fragmentor 170 V, skimmer 65 V.
• Příprava vzorku: Digestion rhEPO trypsinem (50:1 w/w) při 37 °C po 12 h.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace metodiky odhalila výhodu kolony 2.1×250 mm při zachování vysokého rozlišení a úzkých šířek píků i při zkráceném čase analýzy (<35 min celkově).
• Dosáhnuto 100 % pokrytí sekvence rhEPO pomocí Agilent MassHunter MFE a bioinformatického modulu BioConfirm.
• Identifikováno 42 unikátních glykopeptidů s různými N-vázanými glykany, přičemž detailní profil byl extrahován z TIC chromatogramu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a citlivá analýza peptidů i glykopeptidů umožňuje efektivní kontrolu kvality bioterapeutik.
• Vysoká selektivita a rozlišení přispívají k přesnější identifikaci modifikací a lokalizaci glykanačních míst.
• Metoda je vhodná pro validaci procesů výroby a stabilitní studie během životnosti produktu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace α-locálních středněporézních kolon se zdokonalenými povrchovými úpravami pro ještě vyšší účinnost separace.
• Automatizace datové analýzy glykopeptidů s využitím umělé inteligence a strojového učení pro rychlé rozpoznání vzorců modifikací.
• Rozšíření aplikace na další post-translační modifikace, jako jsou oxidace či deamidace, a jejich simultánní kvantifikace.

Závěr

Agilent AdvanceBio Peptide Mapping kolona prokázala vynikající výkon při rychlém a efektivním LC/MS peptidovém mapování rhEPO, umožnila 100 % sekvenční pokrytí a detailní glykopeptidový profil. Metoda poskytuje robustní nástroj pro vývoj a kontrolu kvality biotechnologických léčiv.

Reference

1. L. J. Campbell, J. Y. Le Blanc: Bioanalysis, 3, 645 (2011).