Comprehensive Characterization of the N and O-Linked Glycosylation of a Recombinant Human EPO

Význam tématu

Úprava glykosylace erytropoetinu (EPO) zásadně ovlivňuje jeho biologickou aktivitu, farmakokinetiku a terapeutickou účinnost při léčbě anémie. Detailní znalost N- a O-glykosylace je klíčová pro vývoj, srovnání a kontrolu kvality originálních i biosimilárních přípravků.

Cíle a přehled studie

Autoři představili dvě rychlé a komplementární LC-MS-HILIC strategie pro charakterizaci rhEPO:

• Uvolnění a značení N-glykanů reagencí RapiFluor-MS s následnou HILIC-fluorescenční-MS analýzou.
• Parciální N-deglykozylaci intact rhEPO a rozlišení proteoform O-glykosylace pomocí intact protein HILIC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Sample-prep a značení:

• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit pro rychlé uvolnění a značení N-glykanů.
• Rapid PNGase F s RapiGest SF pro 10minutovou parciální N-deglykozylaci intact proteinu.

Chromatografie a detekce:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolónou Glycoprotein BEH Amide 300Å, 1.7 µm pro HILIC separace.
• Fluorescenční detekce (Ex/Em 265/425 nm pro N-glykany, 280/320 nm pro intact protein).
• Xevo G2-XS QTof pro analýzu uvolněných N-glykanů a SYNAPT G2-S HDMS pro intact protein.

Hlavní výsledky a diskuse

• N-glykanový profil rhEPO je bohatý na tetraantennární, tetrasialylované struktury (FA4G4S4) s různými N-acetyl laktózo-n-expanzemi a významnou frakcí biantennárních disialylovaných forem (FA2G2S2).
• Wide-pore BEH Amide kolóna poskytla o 10–20 % vyšší špičkovou kapacitu pro vysoce rozvětvené glykanové formy.
• RapiFluor-MS značení se Xevo G2-XS QTof zajistilo vysokou citlivost a přesnost hmotnostních měření (chyby < 4 ppm).
• Intact HILIC-MS analýza odhalila více než 10 O-glykoproteoform, zahrnujících aglykozylovanou formu, mono- a disialylované trisacharidové glykoformy a různé C-terminální truncace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá, reprodukovatelná příprava a analýza N-glykanů a intact glykoproteinů v rozsahu minut až desítek minut.
• Možnost kvantitativního a kvalitativního glykanového profilování pro vývoj biosimilárů, srovnávací studia a QA/QC v bioprodukci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými a high-throughput platformami pro glykomické studie.
• Rozšíření metodiky na další glykoproteiny a komplexní biologické léčivé látky.
• Využití ve stabilitních studiích a monitorování glykoproteinových modifikací v reálném čase.

Závěr

Dvě prezentované LC-MS-HILIC strategie umožňují komplexní, citlivou a rychlou charakterizaci N- a O-glykosylace rhEPO. Tento přístup je perspektivní pro vývoj, kontrolu kvality a srovnávací analýzy biosimilárních bioléčiv.

Reference

1. An Z. Protein Cell 2010, 1, 319–330.
2. Bennett CL et al. Semin Thromb Hemost 2012, 38, 783–796.
4. Rush RS et al. Anal Chem 1995, 67, 1442–1452.
5. Dube S et al. J Biol Chem 1988, 263, 17516–17521.
6. Takeuchi M et al. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86, 7819–7822.
8. Harazono A et al. J Pharm Biomed Anal 2013, 83, 65–74.
14. Lauber MA et al. Anal Chem 2015, 87, 5401–5409.
17. Lauber MA, Koza SM. Waters Technology Brief 2015.
20. Lauber MA, Koza SM. Waters Application Note 2015.