Developing a Method to Protect the Integrity of Racing Using Targeted SRM: Detection and Quantitation of rhEPO/DPO in Horse Plasma

Význam tématu

Ve sféře dostihového závodění je odhalování nepovoleného použití rekombinantního lidského erytropoetinu (rhEPO) a darbepoetinu-alfa klíčové pro zajištění férovosti i zdraví zvířat. Nízké hladiny těchto proteinových dopingů v krevní plasmě a komplexní složení biologických vzorků představují výzvy pro analytické metody.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout cílený hmotnostně‐selektivní monitorovací protokol (SRM) k detekci a kvantifikaci rhEPO/DPO v plasmě koní až do 72 hodin po aplikaci. Kombinací imunoafinity, enzymatické štěpení a LC-MS/MS má metoda potvrdit přítomnost několika proteotypických peptidů a měřit jejich koncentrace za použití stabilně značených interních standardů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a přípravu vzorků byla použita imunofixační extrakce s protilátkami navázanými na magnetické částice, následovaná ultrafiltrací a enzymatickým štěpením trypsinem. HPLC analýza probíhala na koloně Hypersil Biobasic C18 (100 × 0,5 mm) s gradientem 2–40 % acetonitrilu v 12 minutách při průtoku 60 µl/min. Cílená SRM měření se realizovala na triple quadrupolu Thermo Scientific TSQ Quantum Access se Surveyor MS Pumpou a MicroAS autosamplerem. Jako interní standardy posloužily těžké izotopově značené analogie diagnostických peptidů rhEPO (T4, T6, T11, T17).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje detekčních limitů pod 0,2 ng/ml (500 amol na kolonu) bez potřeby nano-flow rozhraní. Pro čtyři klíčové proteotypické peptidy rhEPO byla potvrzena vysoká liniarita kvantifikační křivky (CV < 20 %). Retenční časy se mezi pokusy lišily méně než o 10 sekund, což zvyšuje spolehlivost identifikace. V reálném testu na koni aplikovaném dávkou 8000 IU i.v. bylo možné rhEPO detekovat a kvantifikovat i 72 hodin po poslední injekci. Srovnání s ELISA potvrdilo shodu koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita díky více diagnostickým peptidům.
• Spolehlivá kvantifikace s použitím stabilně značených standardů.
• Jednodušší provoz bez nano-flow, vyšší robustnost.
• Možnost implementace v rutinních laboratořích anti-dopingových laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu sledovaných proteinových dopingů a automatizace přípravy vzorků. Integrace vysoko-propustných LC-MS řešení a rozvoj bioinformatických nástrojů pro rychlejší zpracování dat zvýší efektivitu kontroly. Metodu lze adaptovat na další terapeutické proteiny a biologické matice.

Závěr

Prokázaná SRM metoda nabízí citlivou, selektivní a kvantitativní platformu pro odhalování rhEPO/DPO v plasmě koní. Díky stanoveným postupům a interním standardům je vhodná pro anti-dopingové laboratoře vyžadující právně závazné potvrzení přítomnosti zakázaných látek.

Reference

1. Guan F. et al. LC-MS/MS Method in the Confirmation of Recombinant Human Erythropoietin and Darbepoetin-alpha in Equine Plasma. Anal. Chem.
2. Krantz S. B. Erythropoietin. Blood. 1991;77:419–434.
3. Egrie J. C., Browne J. K. Development and Characterization of Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Br. J. Cancer. 2001;84:3–10.
4. Piercy R. J. et al. Erythroid Hypoplasia and Anemia Following Administration of Recombinant Human Erythropoietin to Two Horses. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998;212:244–247.