Successful Transfer of Size-Exclusion Separations Between HPLC and UPLC

Význam tématu

Size-exclusion chromatografie (SEC) je klíčová pro analýzu proteinů a peptidů podle velikosti. Možnost přenášet metody mezi moderními UPLC a tradičními HPLC systémy umožňuje laboratořím bez UPLC nástrojů využít vysoce výkonných separací. Tím se zvyšuje flexibilita, zkracuje doba vývoje metod a zajišťuje konzistentní výsledky napříč různými pracovišti.

Cíle a přehled studie / článku

Popisuje se here metodika přenosu velikostní-exkluzních separací mezi UPLC a HPLC sloupci se stejnou chemickou povrchovou úpravou BEH částic. Ukazují se postupy škálování délky kolony, průtoku a objemu injekce tak, aby byla zachována stejná selektivita a rozlišení při různých velikostech částic i průměrech kolony.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systémy: Waters Alliance HPLC, ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Software: Empower 3
• Kolony BEH SEC 200Å a 450Å: 1,7 µm UPLC (4,6×300 mm), 2,5 µm UPLC (4,6×300 mm), 3,5 µm HPLC (7,8×300 mm nebo série kolonek 7,8×150 + 7,8×300 mm nebo 7,8×450 mm)
• Mobilní fáze: 25 mM fosfátový pufr, 150 mM NaCl, pH 7,2
• Teploty: kolona při teplotě okolí, vzorky při 10 °C
• Detekce: UV absorbance při 280 nm nebo 214 nm
• Vzorky: proteinové standardy Waters a Sigma–Aldrich, koncentrace cca 1 mg/mL

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že příspěvky šíření píků před a za kolonou (extra-column) významně ovlivňují rozlišení především v úzkých kapilárách. Rozlišení je s rostoucím průměrem kolony prakticky konstantní, protože se proporčně zvyšuje objem pórů. Metody škálování délky kolony podle poměru délka/velikost částice (Equation 1), průtoku podle redukované lineární rychlosti (Equation 2) a objemu injekce podle objemu kolony (Equation 3) byly úspěšně demonstrovány na dvou příkladech:

• 200Å sloupce: UPLC 1,7 µm, 4,6×300 mm vs. HPLC dvě kolony 3,5 µm, 7,8×300 mm v sérii (celkem 7,8×600 mm). Výsledné chromatogramy byly téměř identické, UPLC analýza byla 4–5× rychlejší.
• 450Å sloupce: UPLC 2,5 µm, 4,6×300 mm vs. HPLC dvě kolony 3,5 µm, 7,8×150 + 7,8×300 mm v sérii (celkem 7,8×450 mm). UPLC byla přibližně 2× rychlejší při zachování stejné selektivity.

Přínosy a praktické využití metody

Laboratoře disponující pouze HPLC mohou implementovat UPLC-vyvinuté SEC metody bez nutnosti přímých UPLC přístrojů. Metoda umožňuje rychlejší monitoring proteinové agregace v biotechnologickém vývoji, efektivní škálování pro charakterizaci stopových komponent a jednotné standardy mezi pobočkami.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření BEH-povrchů do dalších průměrů pórů a integrace se senzory pro multidimenzionální analýzu. Dále je perspektivní kombinace s hmotnostní spektrometrií, automatizace přípravy vzorků a pokročilé datové zpracování pro vysokoprůtokové screeningové aplikace.

Závěr

BEH-na bázi upravené HPLC sloupce o průměru částic 3,5 µm poskytují kompatibilní chemii s UPLC formátem a umožňují přenos SEC metod mezi UPLC a HPLC. Díky aplikaci jednoduchých vzorců pro škálování délky, průtoku a injekčního objemu lze zachovat selektivitu a vysoké rozlišení při různých systémech. UPLC nabízí výrazné zrychlení analýzy, zatímco HPLC formát zajišťuje dostupnost v běžných laboratořích.

Reference

1. Fountain K. J., Hong P., Serpa S., Bouvier E. S. P., Morrison D. Analysis of Biomolecules by Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography. Waters Corporation, Application Note 2012;720004412EN.
2. Hong P., Koza S., Fountain K. J. Advances in Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Small Proteins and Peptides: Evaluation of Calibration Curves for Molecular Weight Estimation. Waters Corporation, Application Note 2010;WA64226.
3. Gritti F., Guiochon G. On the extra-column band-broadening contributions of modern, very high pressure liquid chromatographs using 2.1 mm I.D. columns packed with sub-2-µm particles. J. Chromatogr. A. 2010;1217(49):7677–7689.
4. Ricker R. D., Sandoval L. A. Fast, reproducible size-exclusion chromatography of biological macromolecules. J. Chromatogr. A. 1996;743(1):43–50.