Ultimate Resolution HPLC-Based Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Small Proteins and Peptides Using 3.5 μm Ethylene Bridged Hybrid (BEH) Particles

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je klíčová technika pro charakterizaci proteinů a peptidů podle velikosti a tvaru. Vysoce kvalitní separace malých proteinů a peptidů je nezbytná v biochemickém výzkumu, farmaceutické výrobě a kvalitativních laboratořích. Zavedení stacionární fáze s částicemi BEH o velikosti 3,5 μm a pórách 125 Å umožňuje dosáhnout vylepšené rozlišení na klasických HPLC přístrojích a zároveň zachovat dlouhou životnost kolon.

Cíle a přehled studie / článku

Tento dokument popisuje vývoj a hodnocení kolony XBridge Protein BEH SEC, 125 Å, 3,5 μm pro analýzu malých proteinů a peptidů pomocí HPLC systémů. Hlavními cíli jsou srovnání s tradičními 5 μm silikagelovými částicemi, posouzení reprodukovatelnosti sérií kolony, stability během dlouhodobého nasazení a možnosti přenosu metod na UPLC platformu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzy byly využity následující instrumentální uspořádání a metody:

• LC systémy: Alliance HPLC, ACQUITY UPLC H-Class Bio System, ACQUITY UPLC
• Detektory: tunable UV (TUV) s 5 mm titanovou flow cell, vlnové délky 214 a 280 nm
• Kolony: XBridge Protein BEH SEC 125 Å, 3,5 μm, 7,8 × 300 mm; ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 125 Å, 1,7 μm, 4,6 × 300 mm; komparátor: silika-diol SEC 125 Å, 5 μm, 7,8 × 300 mm
• Mobilní fáze: fosfátový pufr 25 mM s NaCl 150 mM, pH 7,2; isokratický režim, průtok 0,84 mL/min, teplota vzorků 10 °C
• Injekční objem: standardně 10 μL, vzorky 1 mg/mL
• Softwarové řízení a zpracování dat: Empower Pro verze 2 a 3

Hlavní výsledky a diskuse

Testy se vzorkem myoglobinu (17 kDa) a mixem peptidů prokázaly užší a ostřejší píky na 3,5 μm BEH kolonách oproti 5 μm silikagelovým částicím. Použitím dvou kol ve série a zdvojnásobením průtoku bylo dosaženo dalšího zvýšení rozlišení při zachování času analýzy. Nízká sekundární interakce pro silně bazické peptidy (ubiquitin, aprotinin) potvrzuje neutrální povrch BEH částic. Reprodukovatelnost mezi třemi výrobními šaržemi pro retenční časy vykázala průměrnou odchylku 0,17 min (0,99 % RSD). Kolona vykázala stabilitu po více než 600 injekcích bez výrazného snížení rozlišení monomeru a dimeru myoglobinu. Přenos metody mezi HPLC a UPLC platformou byl úspěšně demonstrován podle chromatografických škálovacích principů – pro HPLC kolonu 3,5 μm byla použita dvojnásobná délka kolon a poloviční lineární rychlost oproti UPLC.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně vyšší rozlišení malých proteinů a peptidů oproti 5 μm HPLC částicím
• Redukce nepříznivých sekundárních interakcí oproti silikagelovým kolonám
• Vysoká reprodukovatelnost mezi kolonymi i výrobními šaržemi
• Odolnost a dlouhá životnost i při mírně zásaditých podmínkách pH
• Možnost plynulé migrace metod na UPLC systémy pro vyšší vzorkovou propustnost

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření BEH SEC technologie směrem k miniaturizaci pro inline procesní analýzy, automatizované QC systémy v biotechnologiích a přizpůsobení novým typům biomolekul. Důležitá je optimalizace pórů a částicových velikostí pro rozsah molekulových hmotností nad 80 kDa nebo pod 1 kDa a integrace s hyphenovanými detekčními moduly (MS, MALS).

Závěr

Kolony XBridge Protein BEH SEC 125 Å, 3,5 μm významně zvyšují výkonnost SEC analýz pro malé proteiny a peptidy na HPLC soustavách. Díky vylepšené mechanické a chemické stabilitě, reprodukovatelnosti a možnosti hladkého přenosu metod na UPLC představují spolehlivé řešení pro různé aplikační prostředí v akademickém výzkumu i v průmyslové kontrole kvality.

Reference

1. Hong P., Koza S., Fountain K.J. Advances in Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Small Proteins and Peptides: Evaluation of Calibration Curves for Molecular Weight Estimation. Waters Corporation, Application Note 720004412EN, 2012.
2. Koza S., Serpa S., Yang H., Bouvier E., Fountain K.J. Advanced HPLC Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins Using 3.5 μm Ethylene Bridged Hybrid (BEH) Particles. Waters Corporation, Application Note 720005202EN, 2015.
3. Koza S., Fountain K.J. Successful Transfer of Size Exclusion Separations between HPLC and UPLC. Waters Corporation, Application Note 720005214EN, 2014.