Biomolecule Purification, Characterization, and Analysis

Význam tématu

Analytické metody pro dělení, purifikaci a charakterizaci biomolekul jsou dnes klíčové pro vývoj léků, diagnostiku a výzkum přírodních procesů. Rychlý rozvoj genomiky, proteomiky a glykomiky vyžaduje robustní, citlivé a reprodukovatelné techniky, které překonají náročné výzvy malých i velkých molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem řešení od společnosti Waters je nabídnout integrované přístrojové, chemické a softwarové platformy pro komplexní bioanalytiku: od aminokyselin, peptidů, proteinů a glykoproteinů až po glykany a oligonukleotidy. Studie předkládá inovativní kolonové sorbenty, chemie derivatizací, kitů pro přípravu vzorku a jednotné pracovní postupy optimalizované pro HPLC, UHPLC, UPLC a LC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: RP (reversed-phase), HILIC, SEC, IEX, HIC
• Kolony: BEH C18, Peptide CSH C18, HSS T3, Polyphenyl RP mAb, Glycan BEH Amide, Oligonucleotide BEH C18, Glycoprotein BEH Amide
• Derivatizace: AccQ•Tag Ultra, Pico•Tag, RapiFluor-MS
• Vzorkovací spotřeba: Oasis µElution, HILIC µElution
• Přístroje: ACQUITY UPLC (binary, quaternary), ACQUITY Arc, ACQUITY H-Class Bio, Alliance HPLC
• Detekce: UV, fluorescence, ESI-MS (Xevo G2-XS QTof, SYNAPT G2-Si HDMS, QDa)
• Software: Empower 2, UNIFI, MassLynx

Použitá instrumentace

HPLC a UPLC systémy Waters s nízkým disperzním objemem, vysoce efektivními čerpadly, termostatovatelnými automaty vzorkovači, tunelovatelnými UV a vysoce rozlišovacími TOF detektory.

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptidy: BEH C18, CSH C18, HSS T3 poskytují vysokou účinnost, variabilní pory a unikátní selektivity ve formické i trifluoroctové kyselině.
• Aminokyseliny: AccQ•Tag Ultra UPLC řešení nabízí analýzu hydrolyzátů i volných aminokyselin (buněčné kultury či potraviny) s vysokou citlivostí a reprodukovatelností.
• Glykany: RapiFluor-MS kit (30 min příprava) s 30× vyšší FLR a MS citlivostí, podpora automatizace a výkon testu s Dextran ladder.
• Glykoproteiny: Glycoprotein BEH Amide 300 Å 1.7 µm kolony rozlišují intaktní glykovarianty, měří obsazenost glykosylačních míst a oddělují mAb podjednotky (IdeS digest).
• Peptidové mapování: RP vs. HILIC separace glykopeptidů umožňují detailní lokalizaci mikroheterogenity.
• Oligonukleotidy: Oligonucleotide BEH C18 1.7 µm a 2.5 µm XP kolony poskytují rozlišení 15–60 mer, kompaktní MS-kompatibilní eluenty.
• SEC: BEH SEC 125/200/450 Å kolony pro agregáty proteinů v širokém rozsahu molekulových hmotností.
• IEX a pH variační metody: BioResolve SCX, Protein-Pak Hi Res IEX a AccellPlus packings pro vysoce citlivé rozlišení nábojových variant.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená propustnost díky rychlým UPLC a UHPLC běhům
• Standardizace metod a snazší transfer mezi laboratořemi
• Podpora kvality díky QC standardům a testovacím směsím
• Možnost automatizace přípravy vzorku a diagnostiky přístrojů
• Reálné analytické workflow od vývoje až po rutinní QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace multi-omics a AI-řízená analýza dat
• Další vylepšení kolonových materiálů pro extrémní pH a teplotu
• On-line hyphenace a miniaturizace pro živé buňky a mikrofluidní platformy
• Personalizovaná biomedicínská analýza s vysokou citlivostí

Závěr

Integrované řešení Waters přináší komplexní, vysoce efektivní a reprodukovatelné analytické postupy pro široké spektrum biomolekul. Synergie inovativních chemických sorbentů, pokročilé instrumentace a softwaru posouvá hranice kvality dat a umožňuje rychlou transformaci výzkumu do aplikované praxe.

Reference

• Whitepaper Waters: Biomolecule Purification, Characterization, and Analysis
• Application notes Waters: 720005409EN, 720005385EN, 720005202EN, 720003875EN, 720004412EN
• Patenty: US 5,296,599; EP 0 533 200 B1 pro AccQ•Tag; BEH Technology™