Separation of Deamidated Peptides with an Agilent AdvanceBio Peptide Plus Column

Význam tématu

Deamidace zbytku glutaminu a asparaginu patří mezi nejběžnější nežádoucí chemické modifikace bílkovin, které mohou ovlivnit stabilitu, účinnost a bezpečnost biotechnologických léčiv. Analyticky je detekce deamidace náročná vzhledem k malé hmotnostní změně (<1 Da) oproti nedeamidované formě. Spolehlivé rozlišení a kvantifikace těchto variant na úrovni peptidů je klíčové pro kontrolu kvality a vývoj monoklonálních protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo porovnat schopnost dvou typů C18 kolon (tradiční Peptide Mapping vs. nová AdvanceBio Peptide Plus s nabitou povrchovou vrstvou) v separaci deamidovaných peptidů z digesátu monoklonální protilátky. Dále byla zkoumána vliv koncentrace modifikátoru mobilní fáze (formiové kyseliny) a náhrada formiové kyseliny za trifluoroctovou na kvalitu rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: digesát monoklonální protilátky (CHO buňky), trypsinová digesce při pH~11 a 60 °C po dobu 4 h pro rychlení deamidace.

Chromatografie:

• Agilent 1290 Infinity II LC
• Kolony: AdvanceBio Peptide Mapping (2,1×150 mm, 2,7 µm, 120 Å) a AdvanceBio Peptide Plus (nabité C18 povrchové částice)
• Mobilní fáze A: voda + modifikátor, B: acetonitril + modifikátor
• Gradient 3–40 % B v 40 min, teplota 60 °C, průtok 0,4 mL/min

Hmotnostní spektrometrie:

• Agilent 6546 Q-TOF s technologií Jet Stream
• Rozsah m/z 300–1700, pozitivní režim, rychlost akvizice 5 spekter/s

Zpracování dat pomocí MassHunter BioConfirm a Qualitative Analysis.

Hlavní výsledky a diskuse

Na standardní Peptide Mapping kolóně se u pěti vybraných peptidů vyskytovalo částečné překrývání nativních a deamidovaných forem, což znesnadňovalo jejich kvantifikaci. Na AdvanceBio Peptide Plus kolóně byly všechny deamidované varianty konzistentně odděleny a elutovaly až po nativní formě. Tento jev je přisuzován iontovým interakcím mezi peptidy (pozitivně nabitými při pH 2) a nabitou povrchovou vrstvou fáze, přičemž deamidace přidáním karboxylové skupiny zvyšuje kyselost a snižuje retenci na konvenčním C18. Úprava koncentrace formiové kyseliny ukázala, že nižší koncentrace (0,05 %) dále zvětšuje selektivitu, zatímco vyšší (0,3 %) mírně snižuje rozlišení. Nahrazení formiové kyseliny TFA vedlo k nižší citlivosti a vyšší pravděpodobnosti koelučních artefaktů.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace nabité C18 fáze umožňuje spolehlivou detekci a kvantifikaci deamidace peptidů bez interferencí překrývajících se izotopů. Metoda podporuje QA/QC procesy v biopharmaceutické výrobě a usnadňuje vývoj stabilnějších proteinových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření použití nabitých fasí pro další posttranslační modifikace (oxidace, glykosylace).
• Optimalizace mobilních fází s heterogenními iontově-párovacími činidly.
• Automatizace metody a integrace do on-line monitoringu během výrobního procesu.
• Vývoj modulárních kolón s řízenou povrchovou funkcionalizací.

Závěr

AdvanceBio Peptide Plus kolona s nabitou povrchovou vrstvou na bázi hybridního C18 významně zvyšuje selektivitu pro deamidované peptidy oproti tradiční C18. Regulace koncentrace formiové kyseliny navyšuje či snižuje rozlišení, zatímco TFA se nedoporučuje kvůli nižší specifičnosti a citlivosti.

Reference

1. Gervais D. Protein Deamidation in Biopharmaceutical Manufacture: Understanding, Control and Impact. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2015, 91, 569–575.
2. Wu L. Quantitation of Chemical Induced Deamidation and Oxidation on Monoclonal Antibodies. Agilent Technologies 2018.
3. Wang W. et al. Quantification and Characterization of Antibody Deamidation by Peptide Mapping with Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 2011, 312, 107–113.
4. Nogueira R., Lämmerhofer M., Lindner W. Alternative HPLC Peptide Separation Using Mixed-Mode Reversed-Phase/Weak Anion-Exchange. J. Chromatogr. A 2005, 1089, 158–169.
5. Apffel A. et al. Enhanced Sensitivity for Peptide Mapping with ESI-LC-MS in Presence of TFA. J. Chromatogr. A 1995, 712, 177–190.