High Resolution and High Throughput Size-Exclusion Chromatography Separations of IgG Antibody Aggregates and Fragments on UHPLC and HPLC Systems with 2.5 μm BEH Particles

Význam tématu

Size-exclusion chromatography je klíčová metoda pro rutinní hodnocení agregátů vysoké molekulové hmotnosti a fragmentů proteinových léčiv, zejména monoklonálních protilátek. Umožňuje neinvazivní analýzu vzorků za ne-denaturačních podmínek a je standardem pro kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává výkonnost kolonek Waters Protein BEH SEC 200 Å s částicemi o průměru 1,7 µm, 2,5 µm a 3,5 µm na systémech UPLC, UHPLC a HPLC. Jako modelový analyzát byl použit rituximab, u něhož byly sledovány vysokomolekulární agregáty HMWS a fragmenty LMWS1 a LMWS2. Cílem bylo určit optimální konfiguraci kolonek pro různé chromatografické systémy.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografické systémy ACQUITY UPLC H-Class Bio a HPLC
• Kolonky ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å 1,7 µm (2,1×150 a 4,6×300 mm), XBridge Protein BEH SEC 200 Å 2,5 µm a 3,5 µm (4,6×150, 4,6×300, 7,8×150, 7,8×300 mm)
• Detekce TUV při 280 nm, teplota kolony ~22 °C, vzorku 10 °C
• Mobilní fáze: 20 mM sodný fosfát, 400 mM NaCl, pH 7,2
• Vzorek: rituximab ~21 mg/ml a BEH200 Protein Standard Mix
• Software Empower 3 pro řízení a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Efektivita separace roste se zmenšujícími se částicemi: sloupcová účinnost (počet destilačních pater) vzrůstá s klesající průměrovou velikostí částic.
• Sloupce 1,7 µm poskytují nejlepší rozlišení HMWS-monomer a LMWS1-monomer, avšak vyžadují LC systémy s nízkou extra-kolonovou disperzí.
• Sloupce 2,5 µm v širším formátu 7,8 mm I.D. nabízejí kompromis mezi vysokou rozlišovací schopností a robustností napříč UPLC, UHPLC a HPLC systémy; odolávají vyšší disperzi a pracují při nižším tlaku.
• Sloupce 3,5 µm poskytují o ~50 % nižší zpětný tlak, jsou ekonomičtější, ale vykazují nižší účinnost ve srovnání s 2,5 µm.
• Porovnání s konkurenčními kolonkami ukázalo, že XBridge 200 Å 2,5 µm vysoce efektivně rozděluje monomer IgG a fragment LMWS1, kde jiné kolony ve srovnání neoddělují LMWS1 dostatečně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci agregátů a fragmentů mAb v dispozici rutinních QC laboratoří i vývojových útvarů. Volba optimální velikosti částic a průměru kolony usnadňuje přenos metody mezi různými instrumentálními platformami a zvyšuje kapacitu analýz během vývojových fází a výrobního monitoringu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zvyšující se poptávka po online monitorování procesů s využitím SEC-MALS povede k rozvoji kolonkových materiálů s vyšší inertností a menšími disperzními objemy. Dále se očekává integrace SEC do automatizovaných bioprocesních linek a rozvoj miniaturizovaných systémů pro rychlou analýzu během výroby.

Závěr

Kolonky BEH SEC 200 Å 2,5 µm v širším formátu 7,8 mm ID nabízejí nejlepší poměr rozlišení, robustness a provozní flexibility na UPLC, UHPLC i HPLC systémech. Pro špičkovou účinnost se 1,7 µm sloupce hodí pro systémy s velmi nízkou disperzí, zatímco 3,5 µm sloupce jsou ideální tam, kde je limitován tlak či rozpočet.

Reference

• 1 Koza SM Bouvier ES Hong P Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Botherapeutics and their Aggregates J Liq Chromatogr Relat Technol 2012 35 2923 2950
• 2 Cordoba AJ Shyong BJ Breen D Harris RJ Non Enzymatic Hinge Region Fragmentation of Antibodies in Solution J Chromatogr B 2005 818 115 121
• 3 Koza SM Reed C Chen W Impact of LC System Dispersion on the Size Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Antibody Aggregates and Fragments Waters Application Note 720006336EN 2018
• 4 Fekete S Guillarme D Influence of Connection Tubing in Modern Size Exclusion Chromatography and its Impact on the Characterization of mAbs J Pharm Biomed Anal 2018 149 22 32
• 5 Koza SM Reed C Chen W Evaluating the Impact of LC System Dispersion on the Size Exclusion Chromatography Analysis of Proteins Waters Application Note 720006337EN 2018
• 6 Patel BA Gospodarek A Larkin M Kenrick SA Haverick MA Tugcu N Multi Angle Light Scattering as a Process Analytical Technology Measuring Real Time Molecular Weight for Downstream Process Control mAbs 2018