<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">Extrakce na pevné fázi</a> (SPE) je běžně volenou metodou přípravy vzorků před analýzou pomocí HPLC a GC. Poskytuje:<ul><li>Čištění vzorku;</li><li>Předkoncentraci analyzované látky;</li><li>Výměnu rozpouštědla.</li></ul>Tato metoda dobře funguje pro homogenní kapalné vzorky, avšak je zřejmé, že pevný vzorek nelze přímo aplikovat na SPE zařízení. V tomto textu se zaměříme na to, jak nejlépe přistupovat k přípravě pevných vzorků před SPE.První fáze předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci pevného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Vybrané rozpouštědlo by mělo:<ul><li>Účinně rozpouštět analyt;</li><li>Účinně rozpouštět matrici vzorku (i když to není nezbytné, pokud je vzorek dobře promíchán s rozpouštědlem);</li><li>Ideálně být slabým rozpouštědlem z pohledu následující SPE fáze. To však nemusí být vždy možné, a proto může být nutné vzorek vysušit a následně rekonstituovat před aplikací na SPE kolonu.</li></ul>Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu pro důkladné promísení a následně centrifugován, aby se usadily nerozpustné složky matrice. Supernatant (kapalná fáze) se poté oddělí a dále zpracovává.V tomto okamžiku je nutné zvolit odpovídající SPE mechanismus:<h3>Metoda reverzní fáze SPE</h3><h4>Mechanismus / slabé rozpouštědlo / silné rozpouštědlo</h4><ul><li>Reverzní fáze – voda/pufr – acetonitril/methanol (nejsilnější je hexan)</li><li>Normální fáze – hexan/heptan – středně polární organická rozpouštědla, jako je DCM, MTBE, IPA (nejsilnější je voda)</li><li>Iontová výměna – vodný pufr s pH, které podporuje iontové výměnné interakce mezi analyzovanou látkou a sorbentem SPE – organické rozpouštědlo, obvykle methanol s úpravou pH pro narušení iontových výměnných interakcí.</li></ul>V tomto bodě je třeba vzít v úvahu jak vlastnosti analytu, tak i rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku. Extrakce na reverzní fázi je účinná pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, např. ve vodě. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středně polárním rozpouštědle, je třeba jej buď zředit, nebo vysušit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kdy musí být vzorky rozpuštěny v hexanu nebo heptanu, aby bylo dosaženo účinné retence analytu během nanášení vzorku na SPE zařízení.Následující příklady mají tento princip ilustrovat:<h4>Extrakce PCB z půdy</h4>PCB jsou hydrofobní a dobře se rozpouštějí v nepolárních rozpouštědlech. Zeminu lze vysušit, zvážit a extrahovat pomocí hexanu nebo heptanu. Po důkladném promíchání a centrifugaci lze získaný roztok aplikovat přímo na kondicionovanou SPE kolonku se silikagelem, čímž se provede extrakce na &nbsp;normální fázi.<h4>Tylosin z masa</h4>Tylosin je antibiotikum s hodnotou log P = 1,0. Extrakcí masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) dojde k narušení hydrofobních interakcí a uvolnění tylosinu. Po centrifugaci bude nutné další naředění vodou, aby se snížila síla rozpouštědla před extrakcí na reverní fázi.<h4>Enilkonazol z pomerančů</h4>Enilkonazol je fungicid běžně používaný v zemědělství, zejména u citrusových plodů. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Jelikož je enilkonazol zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímou retenci na SPE sorbentu se silnými katexovými vlastnostmi (SCX). Tento postup výrazně zjednodušuje extrakci, protože není potřeba žádné ředění vzorku (na rozdíl od extrakce na reverzní nebonormální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by se analyt během nanášení nezachytil).

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Vzhledem ke své povaze vyžadují bioanalytické vzorky často předběžnou úpravu před dalším čištěním pomocí extrakce na pevné fázi (SPE). Každá matrice vzorku představuje své specifické výzvy, jako je odstranění bílkovin z plazmy a séra, rozklad červených krvinek v celé krvi, hydrolýza glukuronidovaných analytů v moči a homogenizace tkáňových vzorků. Tato technická poznámka popisuje běžné postupy předúpravy bioanalytických vzorků.<h4>Plazma/sérum</h4>Předúprava plazmy a séra závisí na povaze analytu. Pokud je analytem kyselina, lze k narušení interakce léčiva s bílkovinami použít 2% kyselinu fosforečnou (20 µl 85% H₃PO₄ na 1 ml plazmy nebo séra). Pokud je analyt zásaditý, použije se 0,1 M hydroxid sodný. Po přidání kyseliny nebo zásady se vzorek promíchá na vortexu po dobu 20–30 sekund a poté odstředí. Supernatant je poté připraven k další analýze.<h4>Celá krev</h4>Pro celou krev existuje několik možných předúprav. Pokud je cílový analyt přítomen v červených krvinkách, je nezbytný krok hemolýzy.<ul><li>Hemolýza: K 0,2 ml celé krve (s analytickým standardem a vnitřním standardem) ve zkumavce o objemu 1,2 ml přidejte 400 µl 2% roztoku síranu zinečnatého/80% methanolu. Promíchejte na vortexu 10–20 sekund a centrifugujte při 14 000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant odeberte k další analýze. Příprava roztoku síranu zinečnatého/methanolu: Do 100ml odměrné baňky přidejte 20 ml vody a 3,6 g ZnSO₄·7H₂O. Po rozpuštění přidejte 100% methanol. Roztok uchovávejte při 2–8 °C po dobu až 7 dnů.</li><li>Osmotický rozklad: Do 1 ml celé krve přidejte vnitřní standard a 4 ml destilované vody. Promíchejte/vortexujte a nechte stát 5 minut. Centrifugujte při 670 × g po dobu 10 minut a peletu zlikvidujte. pH supernatantu upravte přidáním pufru.</li><li>Sonikace: Sonikujte 1 ml celé krve po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Přidejte 3–6 ml vhodného pufru (např. fosfátového). Promíchejte/vortexujte, nechte stát 5 minut a centrifugujte při 670 × g po dobu 15 minut. Supernatant analyzujte.</li></ul>Poznámka: Srovnání výše uvedených předúprav bylo provedeno pro kyselé, zásadité i neutrální léčiva. Nejvyšší výtěžnosti byly dosaženy při zředění vzorku pufrem a použití fyzikální denaturace (sonikace) oproti chemickým metodám. Sonikace účinně narušuje buněčné membrány, a pokud je dodržen uvedený protokol, nedochází k ucpávání.<h4>Sliny</h4>U vzorků ústních tekutin není nutná hydrolýza a lze aplikovat obecný protokol používaný pro plazmu/sérum.<h4>Moč</h4>V případě konjugovaných forem analytu (např. sulfátové nebo glukuronidové) je nutná enzymatická hydrolýza. Ta vyžaduje specifické pH (4–5) a teplotu. Lze také použít kyselou nebo zásaditou hydrolýzu v závislosti na stabilitě analytu.<ul><li>Enzymatická hydrolýza: K 500 µl vzorku (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl kyselého pufru (viz níže) a 20 µl β-glukuronidázy. Vortexujte 5–6 sekund, inkubujte ve vodní lázni při 63 °C po dobu 30 minut. Přeneste do 96jamkové destičky nebo vialky pro autosampler, uzavřete a centrifugujte 10 minut při 2 000 ot./min. Příprava kyselého pufru: (1,0 M octanový pufr, pH 4,0): Rozpusťte 3,0 g ledové kyseliny octové a 4,1 g octanu sodného v 1l odměrné baňce.</li><li>Zásaditá hydrolýza: K 1 ml moči (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl 10 N KOH. Promíchejte, vortexujte a nechte hydrolyzovat 20 minut při 60 °C. Ochlaďte a upravte pH na 3,5–4,0 přidáním 200 µl ledové kyseliny octové.</li><li>Kyselá hydrolýza: K 1 ml moči přidejte 0,25 ml HCl do zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Uzávěr volně připevněte a zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni 60 minut. pH následně upravte na 7 (nebo dle potřeby) pomocí 1,0 N NaOH.</li></ul><h4>Tkáň</h4>Homogenizujte s organickým nebo vodným rozpouštědlem v závislosti na rozpustnosti analytu. Nechte usadit, dekantujte, odstřeďte nebo filtrujte supernatant. Na tkáni proveďte přímou extrakci metodou Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD).

Postupy předúpravy vzorků pro bioanalytické analýzy

Tento technický tip se zabývá některými problémy, které se mohou vyskytnout při <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">extrakci na pevné fázi </a>(Solid Phase Extraction, SPE), se zvláštním zaměřením na výtěžnost analytu (analyte recovery). Výtěžnost vyjadřuje procento analytu, které je během SPE zachyceno a následně eluováno. Další dva běžně používané pojmy související s výtěžností, které mohou být užitečné, jsou:Relativní výtěžnost (Relative Recovery): Nepřímé stanovení zachycení a eluování analytu během extrakčního procesu na základě výtěžnosti vnitřního standardu (sloučeniny se strukturou podobnou cílovému analytu), který je přidán do surového vzorku/matrice před samotným extrakčním postupem.Absolutní výtěžnost (Absolute Recovery): Kvantitativní metoda pro stanovení skutečného množství analytu zachyceného a eluovaného během extrakčního procesu. Výtěžnost analytu je založena na externím standardu, který je přidán do eluátu na konci extrakčního postupu (na rozdíl od vnitřního standardu, který je extrahován společně s analytem).<h5>Projev</h5><ul><li>Výtěžnost analytu je nižší než 100 %.</li></ul><h5>Indicie</h5><ul><li>Analýza nezadržené frakce (mrtvého objemu, void volume) ukazuje, že analyt je přítomen v průtoku (flow-through).</li></ul><h5>Problém</h5><ul><li>Vazba analytu během kroku nanášení vzorku není kvantitativní.</li></ul><h5>Příčiny / Řešení / Doporučení</h5>A. Kondicionování kolony je nesprávné, chybné nebo není optimalizované:<ol style="list-style-type:decimal;"><li>Kondicionujte kolonu methanolem nebo isopropanolem.</li><li>Použijte dostatečné množství methanolu nebo isopropanolu k úplnému smočení sorbentového lože; nechte protéct více než dva objemy kolony pomalu při nízkém vakuu.</li><li>Bezprostředně po methanolu nebo isopropanolu kolonu promyjte jedním objemem kolony roztokem o složení podobném skutečnému vzorku (s upraveným pH), ale bez analytu(ů).</li><li>Nepoužívejte příliš velké množství tohoto druhého „kondicionačního rozpouštědla“ uvedeného v bodě (3) ani jej nenechávejte v koloně příliš dlouho.</li><li>Nepřesušujte kolonu během ani po kondicionování (použijte nízké vakuum přibližně po dobu 1 minuty).</li></ol>B. Vzorek/matrice je v (nebo obsahuje) rozpouštědle, které je „příliš silné“:<ol><li>Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem/roztokem pro podporu vazby (méně polární pro normální fázi, více polární pro reverzní fázi, nižší obsah solí, pufrované a/nebo s upraveným pH pro iontovou výměnu).</li><li>Zvyšte ředění vzorku „slabým“ rozpouštědlem.</li><li>Nanášejte menší množství vzorku.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Snižte průtok během nanášení vzorku.</li><li>Použijte „silnější“ sorbent s vyšší afinitou k analytu.</li><li>Přidejte organický modifikátor (nebo upravte pH) ke zvýšení afinity analytu(ů) k sorbentu.</li><li>Upravte pH vzorku tak, aby byl analyt neutrální pro reverzní fázi nebo nabitý pro iontovou výměnu.</li><li>Přidejte sůl (5–10 % NaCl) ke zvýšení polarity rozpouštědla a ke zlepšení retence vysoce polárních analytů v reverzní fázi.</li><li>Přidejte ion-párovací činidlo ke zlepšení vazby nabitých analytů v reverzní fázi.</li></ol>C. „Hmotnostní přetížení“ kolony (kolona je příliš malá a/nebo celková hmotnost vázaných složek je příliš vysoká):<ol><li>Snižte objem nanášeného vzorku.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.</li><li>Použijte „silnější“ sorbent.</li><li>Snižte průtok během nanášení (pro zlepšení „difuze“).</li><li>Zmenšete vnitřní průměr kolony při zachování stejné hmotnosti sorbentu (zvýšení tlakové ztráty, snížení průtoku a zlepšení „difuze“).</li><li>Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem pro zvýšení kapacity.</li></ol>D. Průtok je během kroku nanášení vzorku příliš vysoký:<ol><li>Snižte průtok během nanášení.</li><li>Zvyšte hmotnost sorbentu.</li><li>Zmenšete vnitřní průměr kolony ke snížení průtoku.</li><li>Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.</li></ol>E. Sorbent je „příliš slabý“ (má nízkou afinitu k analytu ve srovnání se vzorkem/matricí a/nebo ředícím rozpouštědlem):<ol><li>Přepněte na „silnější“ sorbent, sorbent s vyšší hustotou ligandů, z non-endcapped na endcapped sorbent (nebo naopak).</li><li>Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu C („Hmotnostní přetížení kolony“).</li><li>Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu B („Vzorek/matrice obsahuje rozpouštědlo, které je příliš silné“).</li></ol>F. Kondicionační rozpouštědlo je „vymýváno“ velkými objemy vzorku:<ol><li>Přidejte 2 % methanolu nebo isopropanolu do vzorku, aby se zabránilo kolapsu alkylových řetězců během kroku nanášení vzorku.</li></ol>

Řešení problémů při SPE

Při provádění extrakce analytu pomocí <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">SPE</a> obvykle očekáváme 100% výtěžnost (recovery). Pokud je výtěžnost nižší, naznačuje to problém s uvolněním analytu ze sorbentu. Jaké jsou ale důvody, proč může být pozorovaná výtěžnost vyšší, než očekáváme (tj. &gt; 100 %)?<h3>Nejčastější problémy</h3><ul><li>Koeluující interference</li><li>Kontaminanty pocházející z rozpouštědla nebo zvoleného sorbentu</li><li>Poškozený nebo nevhodný interní standard, který zkresluje referenční bod</li><li>Chyby ve výpočtu výtěžnosti</li></ul>Podívejme se na jednotlivé příčiny podrobněji.<h4>Koeluující interference</h4>Tyto látky jsou obvykle přítomny v matrici a cílem SPE kroku je jejich odstranění. Pokud pozorujete výtěžnosti vyšší než 100 %, prvním krokem by měla být kontrola eluátu pomocí ortogonální analytické techniky, která ověří, zda je zvýšená výtěžnost skutečně způsobena koelucí.Pokud je koeluce potvrzena, existuje několik možných řešení:<ol><li>Upravit promývací kroky SPE metody tak, aby se nečistoty selektivně odstranily během promývání</li><li>Zvolit alternativní SPE sorbent, který bude tyto interference lépe odstraňovat. To je obzvlášť efektivní, pokud lze analyt nebo interferující látku selektivně ionizovat – iontoměničové sorbenty velmi často poskytují čistší extrakty než reverzní nebo normální fáze</li><li>Upravit analytickou metodu tak, aby bylo možné oba píky analyticky rozlišit, a tím eliminovat nutnost odstraňovat interferenci již v SPE kroku</li><li>Analyzovat slepý (blank) vzorek plazmy – tím lze identifikovat přítomné nečistoty a tyto signály následně odečíst při výpočtu výtěžnosti</li></ol><h4>Kontaminanty z rozpouštědla nebo sorbentu</h4>Tyto nečistoty bývají přítomny ve výchozích materiálech a mají podobné vlastnosti jako sledovaný analyt. V důsledku toho koeluují s analytem během SPE i následného analytického stanovení.Postup řešení může být následující:<ul><li>Použít výše uvedené strategie pro odstranění koeluujících nečistot</li><li>Protože se nejedná o kontaminanty pocházející z matrice, lze jejich množství stanovit pomocí analýzy blanku sorbentu a tento příspěvek odečíst od hlavního píku při výpočtu</li><li>Před nanesením vzorku lze sorbent ekvilibrovat elučním rozpouštědlem, čímž se potenciální kontaminanty ze sorbentu vyplaví</li><li>Pokud jsou nečistoty zaváděny rozpouštědlem, obvykle problém vyřeší jeho výměna</li></ul><h4>Problémy s interním standardem</h4>Pokud interní standard nevykazuje 100% výtěžnost, budou následné výpočty nepřesné. Osvědčenou praxí je používat interní standard chemicky podobný analyzované látce, který poskytuje stabilnější referenční bod.Pokud existuje podezření, že interní standard není z daného SPE sorbentu při použité metodě správně eluován, lze použít externí standard, který se přidá přímo do elučného rozpouštědla a umožní výpočet absolutní výtěžnosti.<h4>Chyby ve výpočtu výtěžnosti</h4>Je důležité postupovat systematicky a určit, kde k chybám dochází:<ul><li>Chyby ve výpočtech – zkontrolujte všechny výpočty a zohledněte veškeré ředicí faktory</li><li>Chyby v integraci píků – reintegrujte všechny píky a proveďte manuální kontrolní výpočty</li><li>Chyby analytické metody – ověřte, že použitá analytická metoda umožňuje správnou integraci a výpočty. Zajistěte, aby rozpouštědlo použité při nanášení nebylo příliš silné, a proveďte kalibraci v několika koncentračních úrovních pro ověření linearity. Proveďte systematický troubleshooting metody a identifikujte faktory vedoucí ke špatné reprodukovatelnosti</li><li>Detekce – ujistěte se, že zvolený detektor je vhodný a pracuje správně</li></ul>Doufáme, že pro vás byl tento tip užitečný. Podívejte se na naše další materiály věnované <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/techniques/solid-phase-extraction">solid phase extraction (SPE)</a>.Těšíme se na vás příště u dalšího praktického tipu!

Proč je moje výtěžnost vyšší než 100 %?

<h3>Vítejte u našeho nového technického tipu k <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">SPE</a>!</h3>Jaká může být příčina výskytu interferencí po extrakci bez ohledu na použitou analytickou nebo detekční metodu? Níže jsou uvedeny možné zdroje tzv. „záhadných“ píků.<h4>Možná příčina / zdroj a doporučené řešení</h4><ul><li>Kontaminované reagencie: Ověřte čistotu použitých reagencií a aditiv nebo zkuste použít reagencie od jiného dodavatele.</li><li>Předúprava vzorku: Porovnejte chromatogramy předupraveného a nepředupraveného vzorku.</li><li>Nevhodné rozpouštědlo vzorku: Analyty rozpuštěné v příliš silném rozpouštědle mohou být na chromatografickém systému špatně zadržovány a mohou se projevit jako neočekávané nebo interferenční píky. Doporučuje se, aby rozpouštědlo vzorku odpovídalo počáteční mobilní fázi nebo bylo slabší.</li><li>Nesprávná SPE metoda: SPE sorbent nemusel být správně kondicionován a ekvilibrován. Obvykle by se ke kondicionování sorbentu mělo použít nejsilnější rozpouštědlo použité v metodě. Analyzujte frakce z kondicionování, nanášení vzorku a promývání a ověřte, zda se stejné interference objevují i v těchto krocích.</li><li>Vymytí materiálu z SPE kolonky: Před kondicionováním kolonku vyčistěte elučním rozpouštědlem. Pokud jsou reagencie nebo povaha vzorku příliš agresivní pro polypropylenovou SPE kolonku, lze místo ní použít skleněnou nebo PTFE kolonku.</li><li>Degradace / vedlejší reakce: Zkontrolujte reaktivitu a stabilitu všech složek ve vzorku. K degradaci může docházet, pokud jsou sloučeniny citlivé na faktory, jako jsou teplo, světlo, kyseliny, zásady apod. Jednotlivé složky vzorku mohou vzájemně reagovat nebo reagovat s reagenciemi či aditivy.</li></ul>Doufáme, že pro vás byl tento tip užitečný. Brzy se těšte na další technický tip!

SPE troubleshooting – výskyt neočekávaného píku

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Video

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material