Řešení problémů při SPE

Tento technický tip se zabývá některými problémy, které se mohou vyskytnout při extrakci na pevné fázi (Solid Phase Extraction, SPE), se zvláštním zaměřením na výtěžnost analytu (analyte recovery). Výtěžnost vyjadřuje procento analytu, které je během SPE zachyceno a následně eluováno.
Další dva běžně používané pojmy související s výtěžností, které mohou být užitečné, jsou:

Relativní výtěžnost (Relative Recovery):
Nepřímé stanovení zachycení a eluování analytu během extrakčního procesu na základě výtěžnosti vnitřního standardu (sloučeniny se strukturou podobnou cílovému analytu), který je přidán do surového vzorku/matrice před samotným extrakčním postupem.

Absolutní výtěžnost (Absolute Recovery):
Kvantitativní metoda pro stanovení skutečného množství analytu zachyceného a eluovaného během extrakčního procesu. Výtěžnost analytu je založena na externím standardu, který je přidán do eluátu na konci extrakčního postupu (na rozdíl od vnitřního standardu, který je extrahován společně s analytem).

Projev

• Výtěžnost analytu je nižší než 100 %.

Indicie

• Analýza nezadržené frakce (mrtvého objemu, void volume) ukazuje, že analyt je přítomen v průtoku (flow-through).

Problém

• Vazba analytu během kroku nanášení vzorku není kvantitativní.

Příčiny / Řešení / Doporučení

A. Kondicionování kolony je nesprávné, chybné nebo není optimalizované:

1. Kondicionujte kolonu methanolem nebo isopropanolem.
2. Použijte dostatečné množství methanolu nebo isopropanolu k úplnému smočení sorbentového lože; nechte protéct více než dva objemy kolony pomalu při nízkém vakuu.
3. Bezprostředně po methanolu nebo isopropanolu kolonu promyjte jedním objemem kolony roztokem o složení podobném skutečnému vzorku (s upraveným pH), ale bez analytu(ů).
4. Nepoužívejte příliš velké množství tohoto druhého „kondicionačního rozpouštědla“ uvedeného v bodě (3) ani jej nenechávejte v koloně příliš dlouho.
5. Nepřesušujte kolonu během ani po kondicionování (použijte nízké vakuum přibližně po dobu 1 minuty).

B. Vzorek/matrice je v (nebo obsahuje) rozpouštědle, které je „příliš silné“:

1. Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem/roztokem pro podporu vazby (méně polární pro normální fázi, více polární pro reverzní fázi, nižší obsah solí, pufrované a/nebo s upraveným pH pro iontovou výměnu).
2. Zvyšte ředění vzorku „slabým“ rozpouštědlem.
3. Nanášejte menší množství vzorku.
4. Zvyšte hmotnost sorbentu.
5. Snižte průtok během nanášení vzorku.
6. Použijte „silnější“ sorbent s vyšší afinitou k analytu.
7. Přidejte organický modifikátor (nebo upravte pH) ke zvýšení afinity analytu(ů) k sorbentu.
8. Upravte pH vzorku tak, aby byl analyt neutrální pro reverzní fázi nebo nabitý pro iontovou výměnu.
9. Přidejte sůl (5–10 % NaCl) ke zvýšení polarity rozpouštědla a ke zlepšení retence vysoce polárních analytů v reverzní fázi.
10. Přidejte ion-párovací činidlo ke zlepšení vazby nabitých analytů v reverzní fázi.

C. „Hmotnostní přetížení“ kolony (kolona je příliš malá a/nebo celková hmotnost vázaných složek je příliš vysoká):

1. Snižte objem nanášeného vzorku.
2. Zvyšte hmotnost sorbentu.
3. Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.
4. Použijte „silnější“ sorbent.
5. Snižte průtok během nanášení (pro zlepšení „difuze“).
6. Zmenšete vnitřní průměr kolony při zachování stejné hmotnosti sorbentu (zvýšení tlakové ztráty, snížení průtoku a zlepšení „difuze“).
7. Nařeďte vzorek „slabším“ rozpouštědlem pro zvýšení kapacity.

D. Průtok je během kroku nanášení vzorku příliš vysoký:

1. Snižte průtok během nanášení.
2. Zvyšte hmotnost sorbentu.
3. Zmenšete vnitřní průměr kolony ke snížení průtoku.
4. Použijte sorbent s vyšším specifickým povrchem.

E. Sorbent je „příliš slabý“ (má nízkou afinitu k analytu ve srovnání se vzorkem/matricí a/nebo ředícím rozpouštědlem):

1. Přepněte na „silnější“ sorbent, sorbent s vyšší hustotou ligandů, z non-endcapped na endcapped sorbent (nebo naopak).
2. Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu C („Hmotnostní přetížení kolony“).
3. Viz „Řešení/Doporučení“ pro příčinu B („Vzorek/matrice obsahuje rozpouštědlo, které je příliš silné“).

F. Kondicionační rozpouštědlo je „vymýváno“ velkými objemy vzorku:

1. Přidejte 2 % methanolu nebo isopropanolu do vzorku, aby se zabránilo kolapsu alkylových řetězců během kroku nanášení vzorku.