<blockquote><h4>V minulých dílech Shimadzu HPLC Blogu jsme probrali tato témata:</h4><ul><li>Díl 01: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5002">Začínáme</a></li><li>Díl 02: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5022">Základní teorie</a></li><li>Díl 03: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5023">Separační módy</a></li><li>Díl 04: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5100">Chromatografie na reverzních fázích</a></li><li>Díl 05: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5141">Izokratická vs. Gradientová eluce</a></li><li>Díl 06: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5202">Anatomie HPLC instrumentace</a></li><li>Díl 07: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5244">Detektory</a></li><li>Díl 08: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5255">LCMS detektor</a></li><li>Díl 09: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5311">Rovnice rozlišení</a></li><li>Díl 10: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5330">Účinnost kolony</a></li><li>Díl 11: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5373">Retenční faktor (k)</a></li><li>Díl 12: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5388">Selektivita (α)</a></li><li>Díl 13: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/article/5444">Pufr - Část první</a></li></ul></blockquote>Výběr správného pufru a pH pro mobilní fázi je jedna věc, ale při práci s pufrovanou mobilní fází v HPLC nebo UHPLC analýze je třeba zohlednit a dbát ještě na několik dalších věcí. Pro zjednodušení jsme pro Vás připravili přehled nejdůležitějších bodů:<ul><li>Také v HPLC je kvalita výstupu určena kvalitou vstupu. Proto by všechna použitá rozpouštědla měla být alespoň v HPLC nebo MS kvalitě, aby nedošlo ke kontaminaci, která by mohla vést k falešným píkům nebo blokádám v systému. K přípravě vodných rozpouštědel, jako jsou pufrovací roztoky, by měla být vždy použita ultračistá voda.</li><li>Speciální bezpečnostní uzávěry (obrázek 1) jsou dobrým řešením pro ochranu mobilní fáze před kontaminací a ztrátou rozpouštědla v důsledku odpařování. Uzavírají lahve a zároveň zajišťují bezpečný odtok HPLC rozpouštědel přes nasazené kapiláry. K zakrytí lahví s mobilní fází NESMÍ být použita fólie nebo parafilm, protože nezajišťují vzduchotěsné uzavření a mohou vést k extrakci látek, které se mohou do rozpouštědla vyluhovat.</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_1_Spravny_a_nespravny_x_zpusob_uzavreni_lahve_s_mobilni_fazi_dce5b0c8ee.jpg" alt="Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 1: Správný (√) a nesprávný (x) způsob uzavření láhve s mobilní fází" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_1_Spravny_a_nespravny_x_zpusob_uzavreni_lahve_s_mobilni_fazi_dce5b0c8ee.jpg 245w," sizes="100vw" width="1945" height="998"><ul><li>V ideálním případě by měly být pufry připraveny čerstvě v den použití. Ujistěte se, že roztok je čirý, homogenní a neobsahuje nerozpuštěné částice, v případě potřeby jej přefiltrujte přes filtr 0,45 µm. V případě, že jsou pufrovací roztoky skladovány, před použitím v systému se ujistěte, že jsou stále použitelné, protože mají omezenou životnost.&nbsp;</li><li>Většina pufrů poskytuje ideální podmínky pro růst mikroorganismů. Pufrovací roztok, který je delší dobu uchováván při pokojové teplotě, se zakalí, což signalizuje růst mikroorganismů. Tyto kontaminanty mohou způsobit řadu problémů, jako je ucpání systému, znečištění zpětných ventilů a chromatografické interference. Proto je třeba v praxi dodržovat některá preventivní opatření:</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_2_Preventivni_opatreni_k_zabraneni_rustu_mikroorganismu_v_pufrech_pro_HPLC_eaa04c6623.jpg" alt="Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 2: Preventivní opatření k zabránění růstu mikroorganismů v pufrech pro HPLC" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_2_Preventivni_opatreni_k_zabraneni_rustu_mikroorganismu_v_pufrech_pro_HPLC_eaa04c6623.jpg 245w," sizes="100vw" width="1488" height="950"><ul><li>Je nutné zkontrolovat nastavené pH PŘED přidáním jakéhokoli organického rozpouštědla. Před měřením se ujistěte, že je pH metr přesně kalibrován. Ačkoli to není doporučeno, pokud se rozhodnete měřit pH v láhvi s mobilní fází, předem vyčistěte sondu, aby nedošlo ke kontaminaci.</li><li>Těsnění a jiné smáčené části mohou být poškozeny vysokým obsahem solí a/nebo extrémními hodnotami pH. Pro prodloužení životnosti pístu a těsnění je vhodné použít zadní proplach těsnění (obvykle 10–20 % v/v IPA ve vodě) k odstranění všech potenciálně škodlivých zbytků mobilní fáze.</li><li>Rozpustnost pufru je důležitým bodem, který je třeba zohlednit, a závisí na typu pufru, koncentraci, pH a typu použitého organického rozpouštědla. V ideálním případě by sůl měla být zcela rozpustná ve vodě a je třeba dbát na to, aby během gradientové analýzy nedošlo k vysrážení, když se vodný roztok smíchá s organickým rozpouštědlem. Nejlepší je směs předem otestovat, aby se zajistilo, že zůstane v roztoku, protože nerozpustné krystaly se mohou hromadit a způsobit ucpání přístroje. Před experimentem lze provést jednoduchý test smícháním různých částí pufru a organického rozpouštědla ve zkumavce, jak je znázorněno na obrázku 3. Pokud se směs zakalí, sůl není rozpustná v tomto složení mobilní fáze.</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_3_Test_rozpustnosti_pufru_ve_smesi_mobilni_faze_92e8dbbd19.jpg" alt="Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 3: Test rozpustnosti pufru ve směsi mobilní fáze" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_3_Test_rozpustnosti_pufru_ve_smesi_mobilni_faze_92e8dbbd19.jpg 245w," sizes="100vw" width="2232" height="893"><ul><li>Při použití pufru pH, kyseliny nebo zásady pouze v mobilní fázi A, se v gradientové analýze iontová síla mobilní fáze snižuje s rostoucím množstvím organického rozpouštědla (mobilní fáze B). Přidání stejné koncentrace pufru, kyseliny nebo zásady také do organického rozpouštědla (mobilní fáze B) může tomuto jevu zabránit a minimalizovat problémy se sklonem základní linie, gradienty pH a iontové síly a zlepšit linearitu pro nabité sloučeniny, jak je znázorněno na obrázku 4.</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_4_vliv_iontove_sily_d8b5c6f09e.jpg" alt="Shimadzu HPLC Blog: Obrázek 4: Vliv proměnné iontové síly na základní linii v gradientové analýze bazických sloučenin" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_HPLC_Blog_Obrazek_4_vliv_iontove_sily_d8b5c6f09e.jpg 241w," sizes="100vw" width="1488" height="966">Mnoho problémů, které se vyskytují během HPLC nebo UHPLC analýzy, lze připsat kvalitě mobilní fáze nebo ucpání kapilár v důsledku částic zavlečených při dodávce rozpouštědla. Proto je vhodné věnovat pozornost správným postupům při výběru a přípravě rozpouštědel, aby se předešlo trvalým problémům v pozdější fázi. V některém z dalších příspěvků se budeme věnovat radám pro řešení problémů a vysvětlíme si, jak postupovat, pokud se tyto problémy přesto vyskytnou. V příštím článku se však blíže podíváme na stacionární fázi.<blockquote><h5>Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu</h5><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2299">Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/4568">Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/547">Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2495">MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/3378">Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE &amp; Material Testing | Environmental Monitoring</a></li></ul></blockquote><h4>Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=basics+fundumentals">v knihovně LabRulezLCMS</a></h4><ul><li>Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)</li><li>Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace)&nbsp;</li><li>Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)</li><li>SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)</li><li>Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)</li></ul>

Shimadzu HPLC Blog: Pufr - Část druhá

Pokyn Eurachem „Výběr, použití a interpretace programů zkoušení způsobilosti (PT)” [1] doporučuje účastníkům, aby při výběru programu PT zvážili statistický přístup používaný poskytovatelem PT. Tento leták má účastníkům kvantitativních programů PT pomoci lépe porozumět statistickým parametrům, které popisují rozdělení dat ve zprávě o PT. Zpráva o PT by měla také poskytovat informace o tom, jak byla získána vztažná hodnota (xpt), odpovídající nejistota (u (xpt)) a směrodatná odchylka pro posuzování způsobilosti (σpt) [2].Souhrnné statistiky uváděné v programech PT obvykle popisují dvě vlastnosti souboru dat nebo základního normálního rozdělení technicky platných výsledků. Jedním ze znaků je poloha, obvykle popsaná nějakým odhadem střední hodnoty. Druhou vlastností je disperze neboli rozptýlení dat. Další důležitou souhrnnou statistikou je (standardní) nejistota spojená s polohou, která může pomoci určit, zda se zvolený odhad polohy liší (například) od externí referenční hodnoty nebo od jednotlivých nahlášených výsledků. Různé statistiky používané pro tyto účely jsou shrnuty níže.<h5>Poloha výsledků nahlášených účastníky</h5>Odhadovaná poloha se obvykle uvádí, i když není použita jako vztažná hodnota. Norma ISO 13528 [3] popisuje různé způsoby odhadu polohy pomocí aritmetického průměru nebo mediánu, případně pomocí sofistikovaných robustních statistických metod (tabulka 1).Klíčové body, které je třeba mít na zřeteli:<ul><li>Pokud soubory dat obsahují odlehlé hodnoty nebo pokud nelze ověřit symetrii souboru dat, norma ISO 13528 důrazně doporučuje používat robustní odhady.</li><li>Při použití aritmetického průměru by poskytovatel PT za normálních okolností provedl kontrolu souboru dat a odstranil případné odlehlé hodnoty.</li><li>U souborů dat s malým počtem výsledků mohou být všechny odhady polohy nespolehlivé.</li><li>Výrazný rozdíl mezi odhadovanou polohou a referenční hodnotou může svědčit o vychýlení (bias) analytických metod (třeba jen jedné, některých nebo u všech metod), které účastníci použili.</li><li>Pokud účastníci použili různé analytické metody, poskytovatel PT by mohl pro každou z těchto metod uvést odlišné odhadované polohy.</li></ul><h5>Rozptýlení výsledků uváděných účastníky</h5>Směrodatná odchylka je odhad rozptýlení souboru dat. Existují různé možnosti odhadu rozptýlení dat včetně MADe, nIQR, algoritmu A, metody Qn nebo Q (tabulka 1). Často jsou tyto hodnoty normalizovány, aby je bylo možné přímo porovnat se směrodatnou odchylkou normálně rozděleného souboru dat.Klíčové body, které je třeba mít na zřeteli:<ul><li>Rozptýlení se vyjadřuje ve stejných jednotkách jako měřená veličina nebo se uvádí v procentech.&nbsp;</li><li>Při odhadu klasické směrodatné odchylky by poskytovatel PT za normálních okolností provedl kontrolu souboru dat a odstranil případné odlehlé hodnoty.</li><li>Všechny odhady rozptýlení mohou být u souborů dat s malým počtem výsledků nespolehlivé.&nbsp;</li></ul><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Eurachem_CR_Metodickuy_list_29_Tabulka_1_Vyhody_a_nevyhody_ruznych_statistickych_pristupu_469a176384.jpg" alt="Eurachem-ČR: Metodický list 29: Tabulka 1 - Výhody a nevýhody různých statistických přístupů" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Eurachem_CR_Metodickuy_list_29_Tabulka_1_Vyhody_a_nevyhody_ruznych_statistickych_pristupu_469a176384.jpg 245w," sizes="100vw" width="1465" height="655"><h5>Standardní nejistota polohy</h5>Standardní nejistota polohy je mírou spolehlivosti střední hodnoty, která může být pro účastníky důležitá.Klíčové body, které je třeba mít na zřeteli:<ul><li>Standardní nejistota aritmetického průměru se vypočítá jako 𝑢(𝑥̅) = 𝑠/√𝑝, kde s je klasická směrodatná odchylka a p je počet oznámených výsledků.</li><li>Pro jiné odhady průměru ISO 13528 navrhuje použít dodatečný (konzervativní) násobící faktor stanovený na 1,25, tedy&nbsp; 𝑢(𝑥̅) = 1,25 · 𝑠*/√𝑝, kde s je robustní směrodatná odchylka z metody MADe, nIQR, algoritmu A, Qn nebo Q a p počet oznámených výsledků.</li></ul><blockquote>Informace o poskytovatelích PT a jejich programech lze získat od národního akreditačního orgánu, na webových stránkách EPTIS (<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.eptis.org/">https://www.eptis.org/</a>) nebo od jiných národních či mezinárodních organizací.</blockquote><blockquote><ul><li>Produced by the Eurachem Proficiency Testing Working Group - <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.eurachem.org.">www.eurachem.org</a>.&nbsp;</li><li>First Czech edition, March 2025</li><li>Translation and adaptation into Czech by Eurachem-CZ</li></ul></blockquote>

Metodický list 29 – Jak porozumět statistikám PT

Gradientová eluce v HPLC je skvělým nástrojem pro analýzu vzorků, jejichž analyty vykazují široké rozpětí retenčních sil na stacionární fázi zvolené chromatografické kolony. Gradienty však nemusí být vždy ideální z hlediska použití pufrů, zejména pokud se snažíme udržet specifickou hodnotu pH. Pokud je pufr omezen pouze na vodnou mobilní fázi a organická mobilní fáze zůstává čistým organickým rozpouštědlem, může gradient narážet na omezení v rozpustnosti a kolísání pufrační kapacity s rostoucím podílem organické fáze během průběhu gradientu. Tuto nevýhodu lze překonat rovnoměrným rozdělením pufru do obou mobilních fází („slabé“ i „silné“), jak si dále ukážeme na přístupech a příkladech.&nbsp;Co třeba přidat do obou mobilních fází kyselé nebo zásadité aditivum, například 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí (HCO₂H)?&nbsp;Takový přídavek do obou fází může pomoci udržet konzistentní koncentraci aditiva v celkové mobilní fázi během změny poměru mezi „slabou“ a „silnou“ mobilní fází. Nevýhodou tohoto přístupu je však volatilita aditiva, která může způsobit nestabilní protonaci či deprotonaci analytů. A někteří z nás si jistě přiznají, že ne vždy připravujeme (v/v) přídavky zcela přesně. Alternativně lze použít vhodný pufr s odpovídající solí pro konkrétní aditivum, který udrží stálé pH, při kterém je připraven, bez rizika odpařování aditiva.Pufry na bázi mravenčanu amonného (NH₄HCO₂) nebo acetátu amonného (NH₄CH₃CO₂) jsou pro gradientovou eluci nejvhodnější, protože jsou dobře rozpustné v methanolu, zatímco jejich vodné pufry lze mísit i s vysokými poměry acetonitrilu. Potřebná pufrační kapacita bývá zpravidla 5–10 mM v každé fázi. Pro srovnání: při izokratické eluci s mobilní fází 60:40 (20 mM pufr:acetonitril) je výsledná koncentrace pufru pouze 12 mM. Obr. 1 znázorňuje analýzu mykotoxinů na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex™ Bifenyl</a> s 5 mM pufrem acetátu amonného obsaženým ve vodné i methanolové fázi – acetát amonný byl přímo rozpuštěn v methanolu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 1 – Analýza mykotoxinů na Kinetex Biphenyl (ID aplikace 21951)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg 245w," sizes="100vw" width="904" height="475">Při použití acetonitrilu je třeba jej míchat s vodným pufrem, aby byla zachována rozpustnost pufrovací soli. &nbsp;Obr. 2 znázorňuje HILIC analýzu nederivatizovaných aminokyselin na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1542">Biozen™ Glycan</a>, kde byl zásobní pufr (100 mM mravenčan amonný, pH 3,1) přidán do vody i do acetonitrilu v poměru 9:1 (rozpouštědlo:pufr). Výsledná koncentrace pufru v obou fázích byla 10 mM, což udrželo konzistentní pufrační sílu v průběhu gradientu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 2 – Nederivatizované aminokyseliny na bioZen Glycan (technická poznámka 1264)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg 245w," sizes="100vw" width="987" height="486">Fluorid amonný (NH₄F) se často přidává v malém množství (0,1–0,2 mM) do mobilní fáze pro dosažení vysoce citlivých fluoridových aduktů [M+F]⁻ v režimu ESI⁻ nebo pro podporu tvorby iontů [M+H]⁺ nebo [M+NH₄]⁺ v ESI⁺ režimu. Obr. 3 znázorňuje použití třetího rozpouštědlového kanálu, kterým je 1 mM NH₄F dodáván v konstantním poměru 10 % do celkové mobilní fáze, čímž je zajištěna stálá koncentrace 0,1 mM v celém gradientu. Tato metoda je umožněna ternárními nebo kvarterními pumpami, přičemž se doporučuje izokratické zdržení na začátku metody kvůli lepší přenositelnosti metody mezi různými přístroji. Takové gradienty jsou totiž ovlivněny tzv. „dwell volume“, specifickým pro každý HPLC systém, a to i tehdy, pokud je jedno z rozpouštědel dávkováno konstantně.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 3 – Mikrocystiny na Luna Omega Polar C18 (ID aplikace 23568)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1071" height="550">Dejte si pozor na rozpustnost pufrů, pokud chcete do gradientu zařadit pufry jako hydrogenuhličitan amonný nebo fosfátové pufry, zejména právě fosfátové. Při vyšším obsahu organického rozpouštědla může dojít k precipitaci a doporučuje se nejprve provést studii rozpustnosti. A nakonec – nezapomeňte zahrnout použitý pufr také do ředicího roztoku vzorku, aby bylo pH sladěno s mobilní fází. To zlepší tvar píků i reprodukovatelnost. Gradientová eluce, u níž je udržována konstantní pufrační síla a hodnota pH, významně zvyšuje spolehlivost HPLC metody.

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Normal phase SPE (extrakce na normální fázi) využívá polární interakce jako retenční mechanismus. Tyto interakce zahrnují vodíkové vazby, dipól-dipól interakce, indukovaný dipól, π-π interakce atd. Dochází k nim mezi polárními funkčními skupinami analytů a polárními sorbenty.Reversed phase SPE (extrakce na reverzní fázi) využívá nepolární, hydrofobní interakce. Tyto interakce zahrnují Van der Waalsovy síly, disperzní síly (Londonovy síly), π-π interakce atd. Probíhají mezi uhlovodíkovými, hydrofobními částmi analytů i sorbentu.Při práci s matricemi vzorků rozpustnými pouze v organických rozpouštědlech se obvykle volí metoda na normální fázi. Příklady takových matric jsou oleje, tuky nebo máslo.V ideálním případě se vzorek před nanesením na sorbent naředí nepolárním rozpouštědlem (např. hexanem). Poté může být promyt hexanem nebo 5% dichlormethanem v hexanu (analogicky k promývání 5% MeOH ve vodě v metodách reverzní fáze za účelem odstranění interferencí matrice). Eluce se následně provádí polárním rozpouštědlem, které přeruší polární interakce mezi analytem a sorbentem.Frakcionace může být provedena použitím rozpouštědel v pořadí rostoucí polarity, nebo směsí rozpouštědel s různou polaritou.Níže je uveden stručný přehled rozpouštědel podle vzrůstající polarity, používaných při SPE na normální fázi:<h3>Rozpouštědla podle polarity</h3>Od nízké po vysokou polaritu:<ul><li>Hexan</li><li>Isooktan</li><li>Tetrachlormethan</li><li>Toluen</li><li>Benzen</li><li>t-butyl methyl ether</li><li>Chloroform</li><li>Dichlormethan</li><li>Diethylether</li><li>Ethylacetát</li><li>Tetrahydrofuran (THF)</li><li>Aceton</li><li>Acetonitril</li><li>40 % MeOH v acetonitrilu</li><li>20 % MeOH v diethyletheru</li><li>20 % MeOH v dichlormethanu</li><li>Isopropanol</li><li>Methanol</li><li>Voda</li><li>Kyselina octová</li></ul>

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Při stanovení potřebného množství sorbentu pro extrakci na pevné fázi (SPE) je nezbytné zohlednit matrici vzorku (např. sérum, plazma, moč, sliny, potraviny, říční voda, půda atd.). Na základě těchto informací a s využitím vhodné přehledové tabulky lze určit optimální hmotnost SPE sorbentu. Tyto tabulky odrážejí relativní obsah rušivých endogenních složek přítomných ve vzorcích.SPE zařízení musí mít dostatečnou kapacitu pro zachycení všech cílových analytů, stejně jako dalších látek z matrice, které se mohou na sorbent vázat obdobným typem interakce. Pokud je množství sorbentu nedostatečné, může při aplikaci vzorku dojít k průchodu části analytu sorbentem bez navázání, což vede ke snížené výtěžnosti a nižší reprodukovatelnosti mezi jednotlivými analýzami.<h3>Objem vzorku</h3><h4>Určuje hmotnost sorbentu/objem rozpouštědla</h4><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg" alt="Phenomenex: Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE zařízení? Závisí to na koncentraci analytu?" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg 154w," sizes="100vw" width="983" height="992"><h3>Obecné zatížitelnosti sorbentů:</h3><h4>Polymerní sorbenty: 10–15 % celkové hmotnosti sorbentu &nbsp;|&nbsp; Silikátové sorbenty: 5 % celkové hmotnosti sorbentu</h4>Například při použití 60 mg polymerního sorbentu (např.<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Strata"> Strata™-X</a>) lze aplikovat přibližně 500 µl plazmy. Na tentýž sorbent lze ovšem zavést až 2 ml moči, což dokládá, že moč obsahuje výrazně méně rušivých složek než plazma.U typů vzorků, které nejsou zahrnuty v doporučených tabulkách, se doporučuje vycházet z uvedených obecných pravidel – 5 % hmotnosti sorbentu pro silikátové materiály, resp. 10–15 % pro polymerní sorbenty. Rozdíl mezi kapacitou silikátových a polymerních sorbentů je dán jednak vyšším specifickým povrchem polymerních materiálů, jednak vyšší hustotou ligandů – celý povrch polymeru slouží jako stacionární fáze, zatímco u silikátového materiálu se na extrakčním mechanismu reverzní fáze nebo iontové výměny podílí navázaná fáze.

Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE? Závisí to na koncentraci analytu?

Silikagel používaný k plnění HPLC kolon je polymerem křemíku a kyslíku s povrchovými skupinami Si–OH (silanoly). Na tyto silanolové skupiny se navazují funkční skupiny pomocí silanizačního činidla za účelem funkcionalizace základního nosiče.Při funkcionalizaci HPLC kolon není možné dosáhnout 100% pokrytí fáze ani navázat všechny dostupné silanolové skupiny (volné hydroxylové skupiny na povrchu silikagelu) na stacionární fázi. Vlivem sterických překážek se s postupujícím navazováním fáze zvyšuje prostorové omezení, takže další reakce jsou obtížnější než ty předchozí.Bez end-cappingu by na koloně zůstalo značné množství přístupných, vysoce reaktivních zbytkových silanolových skupin, které mohou ovlivnit selektivitu stacionární fáze. Tyto zbytkové skupiny mohou vytvářet silné iontové a polární interakce (často označované jako „sekundární interakce“) s polárními a bazickými skupinami v analyzovaných sloučeninách. Proto je snížení počtu volných silanolů po navázání stacionární fáze pomocí end-cappingu nezbytné.Historicky se k end-cappingu používaly malé hydrofobní skupiny, povahou podobné trimethylsilanu. V posledních letech někteří výrobci zavedli další typy skupin, které dodávají koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=6998&amp;elqTrackId=D5A4A87A868E75FA6693FC5A1E9B3C89&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5A07C3CDAC28222BF387672C6F595E7A5CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*175w36l*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">nový selektivní prvek</a>.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg 245w," sizes="100vw" width="767" height="214">Pokud end-cappingové činidlo obsahuje nabité funkční skupiny, propůjčuje povrchu iontoměničovou funkci a dává koloně iontoměničové vlastnosti spolu s <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8525&amp;elqTrackId=63166B02CED6893A95911CAE6AA3AE95&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5B477F9C56C31BC7CAC9FBFB946361A9ECF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1vag7yn*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">reverzně-fázovými interakcemi</a> vycházejícími z C18 ligandů. Podobně polární skupiny dodávají povrchu polární charakter.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg 245w," sizes="100vw" width="786" height="246">Nyní, když jsme si vysvětlili roli end-cappingu, shrňme si hlavní přínosy funkcionalizace silikagelu v závislosti na použitých chemických skupinách.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg 137w," sizes="100vw" width="640" height="728">Stručně řečeno, nové technologie end-cappingu mohou významně zlepšit analýzu sloučenin, které dříve představovaly chromatografickou výzvu. Například dnes lze dosáhnout vynikajícího tvaru píků a kratších retenčních časů při analýze bazických léčiv pomocí <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=PS">kolon PS-C18</a>. Fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=polar">Polar C18</a> se osvědčila pro retenci metabolitů a fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=XB">XB-C18 </a>poskytuje výbornou chromatografii peptidů, s výrazně vyšší retencí malých polárních peptidů.

Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)

<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">Extrakce na pevné fázi</a> (SPE) je běžně volenou metodou přípravy vzorků před analýzou pomocí HPLC a GC. Poskytuje:<ul><li>Čištění vzorku;</li><li>Předkoncentraci analyzované látky;</li><li>Výměnu rozpouštědla.</li></ul>Tato metoda dobře funguje pro homogenní kapalné vzorky, avšak je zřejmé, že pevný vzorek nelze přímo aplikovat na SPE zařízení. V tomto textu se zaměříme na to, jak nejlépe přistupovat k přípravě pevných vzorků před SPE.První fáze předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci pevného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Vybrané rozpouštědlo by mělo:<ul><li>Účinně rozpouštět analyt;</li><li>Účinně rozpouštět matrici vzorku (i když to není nezbytné, pokud je vzorek dobře promíchán s rozpouštědlem);</li><li>Ideálně být slabým rozpouštědlem z pohledu následující SPE fáze. To však nemusí být vždy možné, a proto může být nutné vzorek vysušit a následně rekonstituovat před aplikací na SPE kolonu.</li></ul>Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu pro důkladné promísení a následně centrifugován, aby se usadily nerozpustné složky matrice. Supernatant (kapalná fáze) se poté oddělí a dále zpracovává.V tomto okamžiku je nutné zvolit odpovídající SPE mechanismus:<h3>Metoda reverzní fáze SPE</h3><h4>Mechanismus / slabé rozpouštědlo / silné rozpouštědlo</h4><ul><li>Reverzní fáze – voda/pufr – acetonitril/methanol (nejsilnější je hexan)</li><li>Normální fáze – hexan/heptan – středně polární organická rozpouštědla, jako je DCM, MTBE, IPA (nejsilnější je voda)</li><li>Iontová výměna – vodný pufr s pH, které podporuje iontové výměnné interakce mezi analyzovanou látkou a sorbentem SPE – organické rozpouštědlo, obvykle methanol s úpravou pH pro narušení iontových výměnných interakcí.</li></ul>V tomto bodě je třeba vzít v úvahu jak vlastnosti analytu, tak i rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku. Extrakce na reverzní fázi je účinná pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, např. ve vodě. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středně polárním rozpouštědle, je třeba jej buď zředit, nebo vysušit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kdy musí být vzorky rozpuštěny v hexanu nebo heptanu, aby bylo dosaženo účinné retence analytu během nanášení vzorku na SPE zařízení.Následující příklady mají tento princip ilustrovat:<h4>Extrakce PCB z půdy</h4>PCB jsou hydrofobní a dobře se rozpouštějí v nepolárních rozpouštědlech. Zeminu lze vysušit, zvážit a extrahovat pomocí hexanu nebo heptanu. Po důkladném promíchání a centrifugaci lze získaný roztok aplikovat přímo na kondicionovanou SPE kolonku se silikagelem, čímž se provede extrakce na &nbsp;normální fázi.<h4>Tylosin z masa</h4>Tylosin je antibiotikum s hodnotou log P = 1,0. Extrakcí masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) dojde k narušení hydrofobních interakcí a uvolnění tylosinu. Po centrifugaci bude nutné další naředění vodou, aby se snížila síla rozpouštědla před extrakcí na reverní fázi.<h4>Enilkonazol z pomerančů</h4>Enilkonazol je fungicid běžně používaný v zemědělství, zejména u citrusových plodů. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Jelikož je enilkonazol zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímou retenci na SPE sorbentu se silnými katexovými vlastnostmi (SCX). Tento postup výrazně zjednodušuje extrakci, protože není potřeba žádné ředění vzorku (na rozdíl od extrakce na reverzní nebonormální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by se analyt během nanášení nezachytil).

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

V tomto technickém tipu se zaměříme na běžný problém asymetrie píku (tzv. tailing), který se objevuje při analýze bazických sloučenin na silikagelu typu A, a představíme dvě strategie, jak tento jev omezit.<h4>Úvod:</h4>První kolony pro chromatografii na reverzní fázi byly založeny na silikagelu typu A. Tyto materiály obsahovaly významné množství kovových nečistot, které způsobovaly, že silanolové skupiny na povrchu siliky vykazovaly zvýšenou a proměnlivou aktivitu. Výrobci se snažili tyto skupiny co nejvíce deaktivovat (endcappingem) po navázání C18 ligandů, aby omezili místa, kde může docházet k iontové výměně. Přesto však bazické sloučeniny často vykazovaly výrazné chvostování. Podívejme se, jak lze toto omezení překonat.<h4>Strategie pro zlepšení tvaru píku:</h4><ul><li>Práce při nízkém pH pomáhá neutralizovat silanolové skupiny na povrchu siliky a zabránit tak iontové výměně. Pro tento účel je vhodný 10–20mM fosfátový pufr o pH 2,5. Při použití acetonitrilu jako organického rozpouštědla je však třeba dbát opatrnosti, aby nedošlo k vysrážení pufru při gradientové eluci.</li><li>Přidání konkurenční báze (tzv. silanolového supresoru) do mobilní fáze. Nejčastěji se používá TEA (triethylamin) v koncentraci 5 mM. Tento přístup funguje na principu, že konkurenční báze se váže na aniontové silanolové skupiny, čímž snižuje jejich dostupnost pro interakce s analyty. Ačkoli je tato strategie účinná, může zkracovat životnost kolony, protože silanolové supresory urychlují hydrolýzu stacionární fáze i endcappingu, což následně zvyšuje expozici siliky a vede k zhoršení tvaru píku.</li></ul>Tyto strategie mohou výrazně omezit chvostování píků, ale nemusí jej zcela eliminovat, jak ukazují chromatogramy na obrázcích A a B.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg" alt="Phenomenex: Omezení tailingu bázických analytů při chromatografii na stacionární fázi ze silikagelu typu A v reverzní fázi: A) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 2,5 : methanol (70:30), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 254 nm; B) Mobilní fáze: 20 mM fosforečnanový pufr draselný, pH = 3 s 400 µL/L triethylaminu : acetonitril (63:37), průtok: 1 mL/min, detekce: UV-Vis při 230 nm." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Overcoming_Peak_Tailing_of_Basic_Analytes_in_Silica_Type_A_Stationary_Phases_in_RP_4c1effe7d3.jpg 245w," sizes="100vw" width="939" height="332">Obrázek A ukazuje, jak kyselé pH mírně zlepšuje tvar píku benzylaminu, zatímco obrázek B zachycuje výraznější zlepšení po přidání triethylaminu jako modifikátoru.<blockquote>Při vývoji nových separačních metod doporučujeme používat silikagel typu B (ultračistý). Plně porézní <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=omega">kolony Luna™ Omega</a> i kolony <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=339&amp;manufacturerItems=50&amp;search=kinetex+">Kinetex™ Core-Shell</a> poskytují vynikající tvar píků i u náročných bazických analytů.</blockquote>

Omezení chvostujících píků bazických analytů při chromatografii na reverzní fázi se silikagelovou stacionární fází typu A

Vzhledem ke své povaze vyžadují bioanalytické vzorky často předběžnou úpravu před dalším čištěním pomocí extrakce na pevné fázi (SPE). Každá matrice vzorku představuje své specifické výzvy, jako je odstranění bílkovin z plazmy a séra, rozklad červených krvinek v celé krvi, hydrolýza glukuronidovaných analytů v moči a homogenizace tkáňových vzorků. Tato technická poznámka popisuje běžné postupy předúpravy bioanalytických vzorků.<h4>Plazma/sérum</h4>Předúprava plazmy a séra závisí na povaze analytu. Pokud je analytem kyselina, lze k narušení interakce léčiva s bílkovinami použít 2% kyselinu fosforečnou (20 µl 85% H₃PO₄ na 1 ml plazmy nebo séra). Pokud je analyt zásaditý, použije se 0,1 M hydroxid sodný. Po přidání kyseliny nebo zásady se vzorek promíchá na vortexu po dobu 20–30 sekund a poté odstředí. Supernatant je poté připraven k další analýze.<h4>Celá krev</h4>Pro celou krev existuje několik možných předúprav. Pokud je cílový analyt přítomen v červených krvinkách, je nezbytný krok hemolýzy.<ul><li>Hemolýza: K 0,2 ml celé krve (s analytickým standardem a vnitřním standardem) ve zkumavce o objemu 1,2 ml přidejte 400 µl 2% roztoku síranu zinečnatého/80% methanolu. Promíchejte na vortexu 10–20 sekund a centrifugujte při 14 000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant odeberte k další analýze. Příprava roztoku síranu zinečnatého/methanolu: Do 100ml odměrné baňky přidejte 20 ml vody a 3,6 g ZnSO₄·7H₂O. Po rozpuštění přidejte 100% methanol. Roztok uchovávejte při 2–8 °C po dobu až 7 dnů.</li><li>Osmotický rozklad: Do 1 ml celé krve přidejte vnitřní standard a 4 ml destilované vody. Promíchejte/vortexujte a nechte stát 5 minut. Centrifugujte při 670 × g po dobu 10 minut a peletu zlikvidujte. pH supernatantu upravte přidáním pufru.</li><li>Sonikace: Sonikujte 1 ml celé krve po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Přidejte 3–6 ml vhodného pufru (např. fosfátového). Promíchejte/vortexujte, nechte stát 5 minut a centrifugujte při 670 × g po dobu 15 minut. Supernatant analyzujte.</li></ul>Poznámka: Srovnání výše uvedených předúprav bylo provedeno pro kyselé, zásadité i neutrální léčiva. Nejvyšší výtěžnosti byly dosaženy při zředění vzorku pufrem a použití fyzikální denaturace (sonikace) oproti chemickým metodám. Sonikace účinně narušuje buněčné membrány, a pokud je dodržen uvedený protokol, nedochází k ucpávání.<h4>Sliny</h4>U vzorků ústních tekutin není nutná hydrolýza a lze aplikovat obecný protokol používaný pro plazmu/sérum.<h4>Moč</h4>V případě konjugovaných forem analytu (např. sulfátové nebo glukuronidové) je nutná enzymatická hydrolýza. Ta vyžaduje specifické pH (4–5) a teplotu. Lze také použít kyselou nebo zásaditou hydrolýzu v závislosti na stabilitě analytu.<ul><li>Enzymatická hydrolýza: K 500 µl vzorku (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl kyselého pufru (viz níže) a 20 µl β-glukuronidázy. Vortexujte 5–6 sekund, inkubujte ve vodní lázni při 63 °C po dobu 30 minut. Přeneste do 96jamkové destičky nebo vialky pro autosampler, uzavřete a centrifugujte 10 minut při 2 000 ot./min. Příprava kyselého pufru: (1,0 M octanový pufr, pH 4,0): Rozpusťte 3,0 g ledové kyseliny octové a 4,1 g octanu sodného v 1l odměrné baňce.</li><li>Zásaditá hydrolýza: K 1 ml moči (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl 10 N KOH. Promíchejte, vortexujte a nechte hydrolyzovat 20 minut při 60 °C. Ochlaďte a upravte pH na 3,5–4,0 přidáním 200 µl ledové kyseliny octové.</li><li>Kyselá hydrolýza: K 1 ml moči přidejte 0,25 ml HCl do zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Uzávěr volně připevněte a zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni 60 minut. pH následně upravte na 7 (nebo dle potřeby) pomocí 1,0 N NaOH.</li></ul><h4>Tkáň</h4>Homogenizujte s organickým nebo vodným rozpouštědlem v závislosti na rozpustnosti analytu. Nechte usadit, dekantujte, odstřeďte nebo filtrujte supernatant. Na tkáni proveďte přímou extrakci metodou Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD).

Postupy předúpravy vzorků pro bioanalytické analýzy

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je národní organizace evropské sítě Eurachem zaměřené na podporu kvality analytických měření a jejich metrologické návaznosti. Je organizací vědeckých, pedagogických a odborných pracovníků oboru analytické chemie, sdružených ke společné činnosti, jejíž účelem je podílet se v České republice na systémových opatřeních vedoucích k zabezpečení jakosti výsledků chemických analýz, osvětové činnosti v tomto oboru a zintenzivnění přenosu informací z vyspělých zemí.

Eurachem

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Naším posláním je šířit informace o produktech firmy Shimadzu v oblasti instrumentálních analytických přístrojů, přístrojů pro testování materiálů a speciálních přístrojů pro life science, jejich prodej a následně - instalace, zaškolení, záruční a pozáruční servis, ověřování a validace a aplikační podpora.

LCMS novinky typu akademie - strana 6

Postupy předúpravy vzorků pro bioanalytické analýzy

Omezení chvostujících píků bazických analytů při chromatografii na reverzní fázi se silikagelovou stacionární fází typu A

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)

Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE? Závisí to na koncentraci analytu?

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Metodický list 29 – Jak porozumět statistikám PT

Shimadzu HPLC Blog: Pufr - Část druhá

Nejbližší akce

Shimadzu at ISC 2026

ISC 2026 - the 35th International Symposium on Chromatography

Odběry vzorků 2026

Webináře

Make your LNP formulation workflow shine with Sunscreen

GLP-1: Assay to Aggregates

Reduce QC Release Risk with Molecule Specific Analytics: QC Ready MALS in Empower™ CDS