Nová kniha ANALÝZA ORGANICKÝCH LÁTEK

<p><strong>Kurz Vám poskytne ucelený přehled o metodách organické analýzy separačních, elektrochemických, spektrálních a kombinovaných, včetně příkladů aplikací v laboratořích různého zaměření.</strong></p>
<h3><strong>Odborný garanti:</strong></h3>
<ul>
<li><strong>prof. Čáslavský</strong> (Ústav výzkumu globální změny AV ČR Brno)</li>
<li><strong>prof. Ševčík</strong> (Karlova univerzita)</li>
<li><strong>doc. Mgr. Renata Komendová, Ph.D.</strong> (Vysoké učení technické v Brně, FCH, Brno)</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Vychází kniha <a href="https://lcms.cz/products/634">&quot;ORGANICKÁ ANALÝZA&quot;</a>, 450 stran</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>Knihu obdrží všichni účastnící kurzu &quot;Analýza organických látek&quot;, který se bude konat ve dnech 10. -12. 10. 2022 v Lednici.</p>
</blockquote>
<blockquote>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Kniha_Organicka_analyza_2022_387cf49d12/Kniha-Organicka-analyza-2022.webp" alt="Nová kniha Organická analýza 2022"/></p>
</blockquote>
<h3><strong>PROGRAM KURZU</strong></h3>
<h4><strong>Pondělí 10. 10. 2022 (13:00 - 19.00)</strong></h4>
<ul>
<li>od 11.00 Registrace účastníků</li>
</ul>
<h5><strong>Postupy analýzy organických látek. Volba analytické metody, ekonomika</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Jiří G. K. Ševčík, DrSc. (Univerzita Karlova Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Metody analýzy organických látek a jejich použití</strong> (20´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Josef Čáslavský, CSc. (Ústav výzkumu globální změny AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Odběr a příprava vzorků k analýze - extrakční techniky, pasivní vzorkování organických polutantů</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>doc. Ing. Martin Adam, Ph.D., prof. Ing. Karel Ventura, CSc., Ing. Petra Bajerová, Ph.D. (Univerzita Pardubice)</li>
</ul>
<h5><strong>Přestávka 14.50 – 15.10</strong></h5>
<h5><strong>Plynová chromatografie</strong> (90´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Jiří G. K. Ševčík, DrSc. (Univerzita Karlova Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Kapalinová chromatografie</strong> (90´)</h5>
<ul>
<li>doc. Ing. Petr Česla, Ph.D., (Univerzita Pardubice)</li>
</ul>
<h5><strong>Superkritická fluidní chromatografie</strong> (40´)</h5>
<ul>
<li>prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. (Farmaceutická fakulta UK, Hadec Králové)</li>
</ul>
<h5><strong>Užitečné informace na portále LabRulez</strong> (10´)</h5>
<ul>
<li>Ing. Ivo Novotný (LabRulez, s.r.o.)</li>
</ul>
<h5><strong>Večeře 19:00</strong></h5>
<p><strong>Od 20.00 si Vám dovolujeme pozvat na posezení v hlavním sále, se skleničkou vína, či burčáku</strong></p>
<h3><strong>Úterý 11. 10. 2022 (8.00 - 18.00)</strong></h3>
<h5><strong>Hmotnostní spektrometrie</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Josef Čáslavský, CSc. (Ústav výzkumu globální změny AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Josef Čáslavský, CSc. (Ústav výzkumu globální změny AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Přestávka 10.00 – 10.20</strong></h5>
<h4><strong>Elektromigrační metody</strong></h4>
<h5><strong>Izotachoforéza, kapilární elektroforéza, epitachoforéza</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>RNDr. Marián Kovaľ, CSc. (Villa Labeco s.r.o. Spišská Nová Ves)</li>
<li>Mgr. Ivona Voráčová, Ph.D. (Ústav analytické chemie AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Afinitní kapilární elektroforéza</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>doc. RNDr. Petr Kubáň, Ph.D. (Masarykova univerzita v Brně)</li>
</ul>
<h5><strong>Gelová elektroforéza</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>doc. RNDr. Petr Kubáň, Ph.D. (Masarykova univerzita v Brně)</li>
</ul>
<h5><strong>Elektrokinetické chromatografické metody</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>doc. Ing. Petr Česla, Ph.D., Ing. Jana Váňová, Ph.D. (Univerzita Pardubice)</li>
</ul>
<h5><strong>Přestávka na oběd 13.00 – 14.30</strong></h5>
<h4><strong>Elektroanalytické metody</strong></h4>
<h5><strong>Úvod + Voltametrie</strong> (45´)</h5>
<ul>
<li>doc. RNDr. Vlastimil Vyskočil, Ph.D., prof. RNDr. František Opekar, CSc. (Univerzita Karlova Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Amperometrie</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>RNDr. Jana Skopalová, Ph.D. (Univerzita Palackého v Olomouci)</li>
</ul>
<h5><strong>Coulometrie</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>prof. Ing. Ernest Beinrohr, DrSc. (Istran, s.r.o. Bratislava)</li>
</ul>
<h5><strong>Přestávka 16.15 – 16.35</strong></h5>
<h4><strong>Spektrální metody</strong></h4>
<h5><strong>Spektrofotometrie</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>doc. Mgr. Renata Komendová, Ph.D. (Vysoké učení technické v Brně)</li>
<li>prof. Ing. Josef Čáslavský, CSc. (Ústav výzkumu globální změny AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Luminiscenční metody</strong> (20´)</h5>
<ul>
<li>doc. Mgr. Renata Komendová, Ph.D. (Vysoké učení technické v Brně)</li>
<li>prof. Ing. Josef Čáslavský, CSc. (Ústav výzkumu globální změny AVČR, Brno)</li>
</ul>
<h5><strong>Krátké sdělení firmy <a href="https://lcms.cz/companies/42">PRAGOLAB s.r.o.</a></strong> (10´)</h5>
<h5><strong>Prezentace firmy <a href="https://lcms.cz/companies/41">2 THETA ASE, s.r.o.</a></strong> (20´)</h5>
<h5><strong>Praktické ukázky laboratorních i mobilních analyzátorů</strong></h5>
<h5><strong>Večeře 18:30</strong></h5>
<h3><strong>Středa 12. 10. 2022 (8.00 – 13.30)</strong></h3>
<h5><strong>Infračervená spektrometrie</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>Ing. Karel Šec (Nicolet CZ s.r.o. Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Ramanova spektrometrie</strong> (30´)</h5>
<ul>
<li>Ing. Tomáš Pekárek, Ph.D. (ZENTIVA, k.s. Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Přestávka 9.50 – 10.30</strong></h5>
<h5><strong>Mobilní analyzátory</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>doc. Ing. Tomáš Černohorský, CSc. (Univerzita Pardubice)</li>
</ul>
<h5><strong>Nukleární magnetická rezonance</strong> (45´)</h5>
<ul>
<li>Ing. Marcela Tkadlecová, CSc. (ZENTIVA, k.s. Praha)</li>
</ul>
<h5><strong>Organická elementární rezonance</strong> (60´)</h5>
<ul>
<li>Ing. Jan Langhans (Povodí Vltavy České Budějovice)</li>
</ul>
<h5><strong>Ukončení kurzu</strong></h5>
<h5><strong>Oběd 12.30</strong></h5>


Kurz Analýza organických látek 2022

Kniha ANALÝZA ORGANICKÝCH LÁTEK 2022

Organická analýza - Elektroseparační metody

<h5><strong>8.2 Afinitní kapilární elektroforéza</strong></h5>
<ul>
<li>8.2.1 Úvod</li>
<li>8.2.2 Princip ACE</li>
<li>8.2.3 Vyhodnocení naměřených dat – Scatchardův graf</li>
<li>8.2.4 Techniky ACE<ul>
<li>8.2.4.1 Analýza rovnovážných směsí</li>
<li>8.2.4.2 Analýza založená na změně elektroforetických mobilit</li>
<li>8.2.4.3 ACE s imobilizovaným ligandem</li>
</ul>
</li>
<li>8.2.5 Aplikace ACE</li>
<li>8.2.6 Závěr</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h3><strong>Afinitní kapilární elektroforéza</strong></h3>
<h4><strong>Úvod</strong></h4>
<p><strong>Afinitní kapilární elektroforéza</strong> (<strong>ACE</strong>) zahrnuje kapilárně elektroforetické metody dělení látek, u kterých se v určité míře uplatňují selektivní, popřípadě i neselektivní interakce, například interakce léčiv (ligandů) s proteiny (receptory) nebo jinými makromolekulárními látkami [1]. Tyto interakce se mohou uplatňovat jak mimo separační kapiláru (např. po smíchání látek tvořících komplex v reakční viálce), tak přímo během separace v separační kapiláře. Nezbytným předpokladem je účinné oddělení volných a vázaných forem interagujících látek, čehož je dosaženo díky vysoké účinnosti a vysoké rozlišovací schopnosti kapilární elektroforézy. Výhodou ACE oproti klasické gelové elektroforéze je to, že se většinou používá separační elektrolyt (BGE), který nezpůsobuje denaturaci molekul a jeho složení se blíží fyziologickým roztokům. Nedochází tak k významnému ovlivnění přirozených rovnováh v systému [2]. ACE lze využít především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami (například interakce léčiv s proteiny, antigenů s protilátkami atd.), výpočet vazebných konstant a vazebných energií, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje proteinů atd.</p>
<h4><strong>Princip ACE</strong></h4>
<p>Kapilární elektroforéza (CE) využívá dělení látek v elektrickém poli na základě jejich rozdílné velikosti a náboje [3]. V případě, kdy jsou v roztoku přítomny látky R a L (například protein a léčivo), mající rozdílné elektroforetické mobility a tvořící spolu komplex R-L, dochází v průběhu separace k ovlivnění migračních časů jednotlivých látek. Vhodnou volbou separačního systému a podmínek ACE je možné měřit jejich vzájemnou interakci právě na základě změn migračních časů. Příklad interakce receptor-ligand je schematicky znázorněn na Obr. níže.  V nepřítomnosti ligandu, L, migruje zóna molekul receptoru, R (např. protein) v separační kapiláře určitou rychlostí (µR) a její migrační čas odpovídá času tR. V přítomnosti ligandu, který s molekulou receptoru interaguje, dochází k ovlivnění migrační rychlosti zóny analytu a jejímu zpomalování, v závislosti na koncentračním poměru R a L. V případě vysycení koncentračních poměrů a vytvoření komplexu R-L budou migrační rychlost a migrační čas odpovídat μR-Lmax a tR-Lmax.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Vliv_interakce_receptor_ligand_na_migracni_cas_receptoru_a_vznikleho_komplexu_67f2a0211e/2-THETA-Obr.-Vliv-interakce-receptor-ligand-na-migracni-cas-receptoru-a-vznikleho-komplexu.jpg" alt="2 THETA: Obr. Vliv interakce receptor-ligand na migrační čas receptoru a vzniklého komplexu"/></p>
<h4><strong>Techniky ACE</strong></h4>
<p>Z praktického hlediska rozlišujeme tři uspořádání, ve kterých je možné ACE provádět [7]. Pokud dochází k interakci v kapalné fázi, jedná se o ACE v homogenním roztoku. Pokud je jedna z interagujích složek imobilizována na stěnách kapiláry, případně na nosiči, jedná se o ACE s imobilizovaným ligandem. Obr 8.20 Rozdělení technik ACE. Techniky ACE prováděné v homogenním roztoku jsou poměrně rozšířené, vzhledem k jejich jednoduchosti, malé spotřebě vzorků (analytů) a jednoduchém vyhodnocení. Jsou použitelné za předpokladu, že dochází k dostatečné separaci volných složek od vznikajících komplexů. V závislosti na stabilitě vzniklého komplexu lze použít buď Analýzu rovnovážných směsí nebo Analýzu založenou na změně elektroforetických mobilit. Na druhou stranu, techniky ACE využívající imobilizace ligandu nebo receptoru na stěny kapiláry nebo na pevném nosiči (kapilární gelová afinitní elektroforéza, kapilární afinitní elektrochromatografie) jsou používány méně často, protože kromě některých výhod (maximální účinnost interakcí) mají také některé nevýhody jako obtížná detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížná regenerace povrchu s navázaným ligandem.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Rozdeleni_technik_ACE_99f69f0feb/2-THETA-Obr.-Rozdeleni-technik-ACE.jpg" alt="2 THETA: Obr. Rozdělení technik ACE"/></p>
<h5><strong>ANALÝZA ROVNOVÁŽNÝCH SMĚSÍ</strong></h5>
<p>Toto uspořádání je vhodné pro systémy s pomalou kinetikou (obvykle stabilní interakce s vysokou afinitou receptor-ligand), u kterých lze jak vzniklý komplex, tak jednotlivé formy interagujícíh látek detekovat pomocí standardních detekčních metod (UV-VIS, LIF). Nutnou podmínkou je dostatečná separace jednotlivých složek směsi (ligand, receptor, komplex) a stabilita vzniklého komplexu. Při splnění podmínky tvorby stabilního komplexu se reakce provádí mimo separační kapiláru a CE slouží pouze k oddělení složek směsi. V praxi se postupuje tak, že jsou receptor a ligand nejprve smíchány v reakční viálce. Postupně se připraví několik směsí s různými koncentracemi látek a všechny tyto směsi se postupně analyzují pomocí CE. </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_postupu_analyzy_rovnovaznych_smesi_d793febf2c/2-THETA-Obr.-Schema-postupu-analyzy-rovnovaznych-smesi.jpg" alt="2 THETA Obr. Schéma postupu analýzy rovnovážných směsí.  Receptor a ligand jsou smíchány mimo separační kapiláru, vzniklý komplex s nezreagovanými analyty je nadávkován na separační kapiláru a složky směsi analyzovány."/></p>
<p>Separační kapilára je naplněna separačním elektrolytem (BGE) bez přídavku receptoru nebo ligandu. Během analýzy dochází k elektromigračnímu oddělení zón receptoru, ligandu a vzniklého komplexu, které jsou detekovány ve formě píků. Plocha píků odpovídá koncentraci jednotlivých složek (je nutno předem provést kalibraci). Pokud je komplex dostatečně stabilní a CE analýza rychlá, nedochází v průběhu separace ke znatelnému rozpadu komplexu. I když k takovému rozpadu komplexu během CE analýzy dojde, koncentrace původních látek (ligand, receptor) se během analýzy nemění, protože jsou od komplexu separovány. </p>
<h5><strong>Kontinuální frontální analýza</strong></h5>
<p>Kontinuální frontální analýza [8] představuje variantu předchozí techniky analýzy rovnovážných směsí. Separační kapilára je také v tomto případě naplněna BGE bez přídavku receptoru a ligandu. Metodu lze použít pouze u reakcí s pomalou kinetikou a je opět potřeba splnit podmínku, že disociace vzniklého komplexu musí být pomalejší než doba analýzy.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_provedeni_kontinualni_frontalni_analyzy_zaznam_z_detektoru_f729b4fbfd/2-THETA-Obr.-Schema-provedeni-kontinualni-frontalni-analyzy-zaznam-z-detektoru.jpg" alt="2 THETA: Obr. Schéma provedení kontinuální frontální analýzy, záznam z detektoru"/></p>
<h5><strong>Metoda částečného plnění</strong></h5>
<p>V tomto uspořádání je kapilára opět naplněna separačním elektrolytem a postupně se nadávkuje malý objem roztoku obsahujícího ligand a roztoku obsahující receptor a dva markery. Oba nadávkované vzorky jsou od sebe odděleny separačním elektrolytem. Markery slouží pro korekci migračního času receptoru, který může být ovlivněn například změnou EOF apod.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Metoda_castecneho_plneni_50fc9d1000/2-THETA-Obr.-Metoda-castecneho-plneni.jpg" alt="2 THETA: Obr. Metoda částečného plnění"/></p>
<h5><strong>ANALÝZA ZALOŽENÁ NA ZMĚNĚ ELEKTROFORETICKÝCH MOBILIT</strong></h5>
<p> V tomto uspořádání je receptor (nebo ligand) přidán do separačního elektrolytu (BGE). Většinou se volí separační systém tak, aby větší molekula (např. receptor/protein) byla přidána do BGE a menší, interagující látka (ligand/léčivo) se nadávkuje do separační kapiláry. V důsledku interakce ligandu s receptorem přítomným v BGE dochází ke změně migračního času ligandu, a to právě v závislosti na koncentraci receptoru v BGE. Toto uspořádání je vhodné použít pro systémy, kdy je vytvořený komplex málo stabilní (afinita R-L je nízká), ale kinetika tvorby komplexu je rychlá.</p>
<h5><strong>Metoda Hummel-Dreyerova</strong></h5>
<p>Hummel-Dreyerova metoda v ACE (původně vyvinutá v roce 1962 pro analýzu gelovou chromatografií) spočívá v provedení série analýz, kdy je kapilára naplněna BGE s měnící se koncentrací nízkomolekulárního ligandu (L) a dávkuje se malé množství receptoru(R).</p>
<h5><strong>Vakantní metoda</strong></h5>
<p>Metoda vyvinutá v roce 1997 [11] spočívá v naplnění kapiláry BGE, receptorem a ligandem. Provede se série analýz se stálou koncentrací receptoru (R) a měnící se koncentrací ligandu (L). Přítomnost receptoru a ligandu způsobuje vysokou absorbanci BGE. Dávkuje se malé množství BGE neobsahující ani L ani R.</p>
<p><strong>ACE S IMOBILIZOVANÝM LIGANDEM</strong></p>
<p>V tomto uspořádání je ligand imobilizován na stěnu separační kapiláry nebo na nosič (částice, polymerní materiály). Molekuly receptoru přítomné v roztoku se při průchodu separační kapilárou navážou na imobilizovaný ligand. V závislosti na afinitě vůči imobilizovanému ligandu dochází ke zpomalování molekul receptoru, zatímco neinteragující látky migrují bez změny rychlosti. Porovnáním pohyblivosti jednotlivých látek v systému bez ligandu lze určit, které molekuly mají afinitu k použitému ligandu a ze stupně retardace a koncentrace imobilizovaného ligandu lze stanovit též disociační konstantu komplexu separovaná látka - ligand. Tato technika je ale v praxi méně používaná, z důvodu obtížné detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížné regenerace povrchu s navázaným ligandem. Využívá se však například pro specifický záchyt a obohacení vybraných látek (receptorů). </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Technika_ACE_s_imobilizovanym_ligandem_c331933f4a/2-THETA-Obr.-Technika-ACE-s-imobilizovanym-ligandem.jpg" alt="2 THETA: Obr. Technika ACE s imobilizovaným ligandem"/></p>
<h4><strong>Aplikace ACE</strong></h4>
<p>ACE nachází využití především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami, dále k výpočtu vazebných energií, stanovení vazebných konstant, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje protein atd. Hlavní uplatnění nachází ACE při studiu interakcí léčiv (léčivo-protein, léčivo glycoprotein, interakce antibiotik, DNA), studiu interakcí typu enzym—inhibitor, enzym-substrát, antigen-protilátka, hormon-receptor, lektin-sacharid, atd. Významné jsou studie například z hlediska farmakologického, protože umožňují sledovat například účinnost nasazené léčby, monitorovat koncentraci aktivní formy léčiva (volné, vázané) v biologických tekutinách a studium selektivních biologických procesů. Využití ACE bylo shrnuto v několika nedávných přehledných článcích [7, 12, 13]. Vybrané příklady studovaných interakcí jsou shrnuty v Tabulce níže. </p>
<h5>Tabulka: Příklady studovaných interakcí</h5>
<ul>
<li><strong>Studovaná interakce</strong> / <strong>Technika</strong></li>
<li><strong>Interakce HSA s léčivy (warfarin, antihistaminy, Hg, chloroquine, atd.)</strong> / <strong>ACE, FACE</strong></li>
<li><strong>Interakce BSA s léčivy</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce proteinů s heparinem</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce protilátka-antigen</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce proteinů s malými molekulami</strong> / <strong>ACE, PFACE</strong></li>
<li><strong>Interakce proteinů s kovy</strong> / <strong>ACE</strong>  </li>
<li><strong>Interakce polymer-polymer</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce DNA-polymer</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce cyklodextrinů s malými molekulami</strong> / <strong>ACE</strong></li>
</ul>
<h3><strong>Závěr</strong></h3>
<p>ACE je vysoce účinná separační metoda vhodná ke studiu interakcí, především ke stanovení disociačních a vazebných konstant a stechiometrie reakcí. Její výhodou je vysoké rozlišení, krátká doba analýzy (vhodné pro méně stabilní rovnováhy) a malá spotřeba vzorku spojená s nízkými náklady na celkovou analýzu. Výhodou je také možnost simultánního stanovení více látek v jedné analýze a studium jejich interakce se stejným ligandem. ACE je vhodnou komplementární technikou k afinitní HPLC a dalším technikám (ELISA, radioimunologické metody, NMR, gelová elektroforéza atd.), které se používají ke studiu interakcí látek. Lze očekávat, že s rozvojem kapilárně elektroforetických metod si ACE zachová statut významné techniky vhodné k určování struktury a interakcí biologicky aktivních látek. Vývoj nových technologií (mikročipová elektroforéza, vtištěné polymery, monolytické nosiče) a vývoj citlivých detekčních metod bude mít pro využití aplikačního potenciálu ACE v budoucnosti velký význam.</p>


Organická analýza - Elektroseparační metody (ACE)

<h3><strong>6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE</strong></h3>
<h5><strong>6.1 Teoretické základy</strong></h5>
<h5><strong>6.2 Konstrukce hmotnostního spektrometru</strong></h5>
<ul>
<li>6.2.1 Ionizační techniky<ul>
<li>6.2.1.1 Elektronová ionizace (EI)</li>
<li>6.2.1.2 Chemická ionizace (CI)</li>
<li>6.2.1.3 Elektrosprej</li>
<li>6.2.1.4 Chemická ionizace za atmosférického tlaku</li>
<li>6.2.1.5 Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)</li>
<li>6.2.1.6 MALDI</li>
<li>6.2.1.7 Indukčně vázané plazma (ICP)</li>
<li>6.2.1.8 Iontové zdroje pro přímou analýzu vzorku</li>
</ul>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h3><strong>Teoretické základy</strong></h3>
<p><strong>Hmotnostní spektrometrie</strong> je analytická metoda založená na interakci iontů s elektrickým, případně magnetickým polem. Pojmem „pole“ (případně „fyzikální pole“) se rozumí oblast v prostoru, která silově působí na specie schopné s tímto polem interagovat. </p>
<p><strong>Elektrické pole</strong> je vytvářeno elektricky nabitým tělesem. Podle závislosti na čase lze definovat nestacionární (časově proměnné) a stacionární (časově neměnné) elektrické pole. Tvar elektrického pole (a tedy i směr působení síly) je popisován siločárami, které vycházejí z kladné elektrody a vstupují do záporné, přičemž tečny v jednotlivých bodech ukazují směr působení elektrického pole. Dvěma základními tvary jsou homogenní (siločáry probíhají rovnoběžně) a radiální elektrické pole (siločáry vycházejí z jednoho bodu nebo do něj vstupují). V hmotnostní spektrometrii se využívá homogenní elektrostatické pole, které je vytvářeno vkládáním stejnosměrného napětí na dvě deskové elektrody, které mohou být rovinné nebo zakřivené. V tomto případě bývá elektrostatické pole stacionární. Nestacionární elektrické pole se využívá v analyzátorech s tyčovými nebo prstencovými elektrodami.</p>
<p><strong>Magnetické pole</strong> je vyvoláno pohybujícím se elektrickým nábojem (tedy elektrickým proudem), lze jej tedy pozorovat okolo elektrických vodičů. Orientaci siločar magnetického pole v okolí přímého vodiče určuje Ampérovo pravidlo pravé ruky: položíme-li ruku na vodič tak, že palec ukazuje směr protékajícího proudu (od kladného pólu k zápornému), pak zahnuté prsty ukazují orientaci siločar magnetického pole. U permanentních magnetů je magnetické pole vytvářeno tzv. vázanými elektrickými proudy. V hmotnostní spektrometrii je magnetické pole generováno pomocí elektromagnetů tvořených cívkou. Pro zesílení je do cívky vkládáno jádro z magneticky měkkého materiálu (magnetický efekt vykazuje pouze při průchodu proudu).</p>
<h3><strong>Konstrukce hmotnostního spektrometru</strong></h3>
<p>Základní části hmotnostního spektrometru jsou:</p>
<ul>
<li>(i) iontový zdroj, sloužící k převedení neutrálních molekul na ionty;</li>
<li>(ii) analyzátor, sloužící k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z);</li>
<li>(iii) detektor převádějící intenzitu jednotlivých fragmentů na elektrický signál;</li>
<li>(iv) vakuový systém, udržující ve spektrometru požadovanou úroveň vakua, podle typu analyzátoru 10¯³ až 10¯¹¹ Pa; </li>
<li>(v) systém pro řízení hmotnostního spektrometru a pro sběr a zpracování naměřených dat.</li>
</ul>
<h4><strong>Ionizační techniky</strong></h4>
<p>Základním předpokladem úspěchu hmotnostně spektrometrického experimentů je úspěšná ionizace vzorku. První ionizační technikou v hmotnostní spektrometrii, dnes už nevyužívanou, byl elektrický výboj v plynech [1]. Během vývoje byla ionizačním technikám věnována značná pozornost a postupně byla navržena řada různých uspořádání, z nichž pouze malá část se v současnosti využívá. Ty budou v následujícím textu podrobněji popsány.<br/>V organické hmotnostní spektrometrii lze ionizovat vzorky ve všech třech skupenstvích. Pro plynné vzorky se nejčastěji využívá elektronová ionizace (<strong>EI, Electron Ionization</strong>), případně ionizace chemická (<strong>CI, <a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3&amp;search=Chemical+Ionization">Chemical Ionization</a></strong>). Pro vzorky kapalné jsou využívány tzv. sprejovací techniky za atmosférického stavu: elektrosprej (<strong>ESI, <a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3&amp;search=Electron+Ionization">Electrospray Ionization</a></strong>), chemická ionizace za atmosférického tlaku (<strong>APCI, <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31&amp;search=Atmospheric+Pressure+Chemical+Ionization">Atmospheric Pressure Chemical Ionization</a></strong>) a fotoionizace za atmosférického tlaku (<strong>APPI, <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31&amp;search=Atmospheric+Pressure+Photoionization">Atmospheric Pressure Photoionization</a></strong>). Pro vzorky pevné je nejdůležitější ionizační technikou MALDI (<strong><a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=25">Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization</a></strong>). Pro prvkovou analýzu organických i organokovových sloučenin je pak využívána <a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=83"><strong>ionizace pomocí indukčně vázaného plazmatu</strong></a> (<strong>ICP</strong>).</p>
<h5><strong>ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI)</strong></h5>
<p>Tato technika je podle starší terminologie označována jako „ionizace nárazem elektronu“ (<strong>Electron Impact Ionization</strong>). Poprvé ji popsal H. D. Smyth roku 1922 jako metodu pro určování ionizačních potenciálů látek [2], ale záhy ji použil pro ionizaci plynných prvků – např. dusíku [3], vodíku [4], oxidu uhličitého [5] a řady dalších. Principem je interakce elektronů urychlených na kinetickou energii 70 eV s neutrálními molekulami, při které dochází k vyražení elektronu z elektronového obalu molekuly za vzniku radikálkationtu, označovaného též jako molekulový ion:</p>
<p>M + 𝑒⁻ → M⁻▪ + 2 𝑒⁻</p>
<p>Nadbytek energie předaný při interakci (ionizační energie organických sloučenin se nejčastěji pohybuje v rozmezí 8–14 eV) pak vede k fragmentaci molekulového iontu za vzniku nabitých fragmentů F (nejčastěji se sudým počtem elektronů) a neutrálních ztrát N (nejčastěji ve formě radikálů):</p>
<p>M⁻▪ → F₁ + N₁▪ + F₂ + N₂▪ + ...</p>
<p>Vzhledem k velkému množství energie předávanému ionizované spécii při interakci s ionizujícím elektronem je elektronová ionizace označována jako tvrdá ionizační technika. Při EI jsou produkovány pouze kationty. </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_iontoveho_zdroje_pri_elektronove_ionizaci_3ddade67dc/2-THETA-Schema-iontoveho-zdroje-pri-elektronove-ionizaci.jpg" alt="2 THETA: Schéma iontového zdroje při elektronové ionizaci. Vzorek je přiváděn kolmo k směru ionizujících elektronů (kolmo na plochu papíru)"/></p>
<p>Schéma iontového zdroje pro elektronovou ionizaci je uvedeno výše. Elektrony jsou emitovány ze žhaveného vlákna nazývaného filament (česky vlákno), a jsou přitahovány k protilehlé elektrodě označované jako trap (česky lapáček). Elektrické pole jim uděluje kinetickou energii 70 eV (1 eV = 1,602.10¯¹⁹J). Permanentní magnet přispívá k prodloužení dráhy letu ionizujících elektronů tím, že z přímé trajektorie vytváří šroubovici, a tím zvyšuje pravděpodobnost jejich interakce s neutrální molekulou. Elektroda označovaná jako repeler (vytěsňovací elektroda) pak slouží k vypuzení vzniklých iontů směrem k analyzátoru. V iontovém zdroji je udržováno vakuum na úrovni 10¯³ Pa, čímž se zabrání kolizím vzniklých iontů, ať již mezi sebou nebo s neutrálními molekulami.</p>
<p>Fragmentace při energii ionizujících elektronů 70 eV je reprodukovatelná. Díky tomu má elektronová ionizace jedinečnou výhodu, kterou je možnost vytváření rozsáhlých knihoven hmotnostních spekter (obsahujících dnes přes půl milionu záznamů). Neznámou sloučeninu lze pak identifikovat porovnáním experimentálního spektra s knihovnou. Další výhodou je velmi dobrá znalost fragmentačních mechanismů jednotlivých tříd sloučenin [6], umožňující vyřešení struktury analyzované sloučeniny v případě selhání identifikace pomocí knihovny. Nevýhodou elektronové ionizace je omezená použitelnost pouze pro těkavé a termostabilní sloučeniny, a v některých případech i malá intenzita nebo úplná absence molekulárního iontu nesoucího informaci o molekulové hmotnosti analyzované sloučeniny. </p>
<h5><strong>CHEMICKÁ IONIZACE (CI)</strong></h5>
<p>Chemická ionizace byla poprvé popsána roku 1966 Munsonem a Fieldem [7], jevy související s touto technikou byly však pozorovány podstatně dříve. Již roku 1916 pozoroval Dempster v hmotnostním spektru vodíku pík s m/z = 3, který vysvětlil jako H⁺₃ [8]. Roku 1952 sovětský vědec Viktor Lvovič Talrose pozoroval ve spektru methanu neobvykle intenzivní ion s m/z = 17 a objasnil jeho vznik ion-molekulární reakcí radikálkationtu a neutrální molekuly methanu [9]:</p>
<p>CH₄⁺▪ + CH₄   → CH₅⁺ + CH₃▪</p>
<p>Výše uvedené jevy byly způsobeny nedostatečně kvalitním vakuem v iontovém zdroji, kdy docházelo ke kolizím vzniklých iontů s neutrálními molekulami. Tento princip byl pak využit při chemické ionizaci, kdy v prvním kroku je elektronovou ionizací ionizován reakční plyn (např. methan, isobutan, amoniak), kterého je v iontovém zdroji výrazně více než analyzované látky (v poměru cca 10⁴:1). Tlak v iontovém zdroji je v důsledku nátoku reakčního plynu podstatně vyšší než při elektronové ionizaci (obvykle v rozmezí 10–100 Pa), takže ion-molekulárními reakcemi dochází ke vzniku reaktivních spécií.</p>
<h5><strong>ELEKTROSPREJ</strong></h5>
<p>Elektrosprej je hodnocen jako jedna z nejvýznamnějších ionizačních technik posledního období. V podstatě se nejedná o ionizační techniku v pravém slova smyslu, ale o metodu převodu iontů z kapalné do plynné fáze. Tato technika byla ve funkci hmotnostně spektrometrického iontového zdroje poprvé využita roku 1968, kdy Malcolm Dole takto úspěšně analyzoval polystyren s molekulovou hmotností přesahující 50 kDa [10]. Pro analýzu organických látek byl elektrosprej poprvé využit roku 1984 [11], rok poté byla tato technika využita pro sekvenování peptidů [12]. Významným mezníkem ve využití elektrospreje bylo objevení jeho schopnosti mnohonásobně nabíjet biopolymery (peptidy, proteiny a další), což umožnilo analyzovat makromolekuly na přístrojích se standardním hmotnostním rozsahem [13]. Za tento objev obdržel jeho autor John B. Fenn roku 2002 Nobelovu cenu za chemii.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_elektrospreje_502f60c8c0/2-THETA-Schema-elektrospreje.jpg" alt="2 THETA: Schéma elektrospreje"/></p>
<p>Schéma klasického elektrospreje je uvedeno na výše. Vzorek je přiváděn do sprejovací kapiláry (zpravidla nerezové), na kterou je vkládáno vysoké napětí (typicky 4 kV); protielektrodou je vstup do hmotnostního spektrometru. Působením elektrostatických sil dojde k vytvoření tzv. Taylorova kužele, z jehož vrcholku jsou sprejovány mnohonásobně nabité kapénky roztoku vzorku. Odpařováním rozpouštědla v důsledku zvýšené teploty ve sprejovacím prostoru (zpravidla je využíván sušící plyn s teplotou nad 300 °C) dochází ke zmenšování kapének, což vede ke zvyšování odpudivých sil mezi souhlasně nabitými molekulami vzorku. Proti těmto silám působí povrchové napětí kapaliny, které se snaží udržet kapénku vcelku. Mez, kdy se tyto síly vyrovnají, je označována jako Rayleighův limit. Po jeho překročení dochází k tzv. Coulombické explozi, kdy se kapénka rozpadne na řadu menších, a proces se opakuje až do uvolnění individuálních iontů</p>
<p>Sprejování pomocí elektrostatického pole se využívá v nanoelektrospreji, kde jsou velmi nízké průtoky (jednotky až stovky nL/min). Při spojení s kapalinovou chromatografií, kde průtok mobilní fáze je podstatně vyšší, je zapotřebí použít podpůrného sprejovacího mechanismu, kterým je dnes nejčastěji pneumatické zmlžování, kdy zmlžovací plyn (nejčastěji dusík) se přivádí kapilárou soustředně umístěnou vně kapiláry sprejovací. Někdy se pro pneumaticky podporovaný elektrosprej používá označení „ionspray“,</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Pneumaticky_podporovany_elektrosprej_Ionspray_bocni_prurez_a6ab66786e/2-THETA-Pneumaticky-podporovany-elektrosprej-(Ionspray)-bocni-prurez.jpg" alt="2 THETA: Pneumaticky podporovaný elektrosprej (Ionspray) – boční průřez"/></p>
<h5><strong>CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU</strong></h5>
<p>Tuto ionizační techniku poprvé použil E.C. Horning v roce 1974 [15]. Schéma tohoto iontového zdroje je uvedeno na níže. Vzorek je pneumaticky zmlžován do vyhřívané odpařovací komůrky, páry rozpouštědla a analyzovaných látek jsou vedeny do prostoru koronového výboje vytvářeného napětím vkládaným mezi koronovou jehlu a vstupní kapiláru. Zde dochází k ionizaci par rozpouštědla (které jsou ve velkém přebytku), a vzniklé reaktivní produkty pak ion-molekulárními reakcemi ionizují molekuly analyzovaných látek.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Chemicka_ionizace_za_atmosferickeho_tlaku_APCI_ad403156a1/2-THETA-Chemicka-ionizace-za-atmosferickeho-tlaku-(APCI).jpg" alt="2 THETA: Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)"/></p>
<h5><strong>FOTOIONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APPI)</strong></h5>
<p>Tato technika byla poprvé popsán roku 2000 [16]. Konstrukčně je tento iontový zdroj prakticky shodný s APCI, pouze namísto koronové jehly je zde umístěn zdroj UV-záření, jehož fotony poskytují energii pro ionizaci.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Fotoionizace_za_atmosferickeho_tlaku_APPI_218a4ea59b/2-THETA-Fotoionizace-za-atmosferickeho-tlaku-(APPI).jpg" alt="2 THETA: Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)"/></p>
<h5><strong>MALDI</strong></h5>
<p>Technika MALDI (<strong>Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>, desorpce/ionizace laserem za účasti matrice) ionizuje z pevného stavu. Je vhodná pro ionizaci makromolekul – biopolymerů i syntetických polymerů s molekulovou hmotností přesahující 1 MDa. Tato technika byla poprvé publikována v roce 1988; Koichi Tanaka se spolupracovníky využili kapalné matrice – glycerínu s ultrajemným práškovým kobaltem [17], zatímco Karas s Hillenkampem použili jako matrice pevnou látku – kyselinu nikotinovou [18]. Tanaka byl za objev MALDI oceněn jednou čtvrtinou Nobelovy ceny za chemii v roce 2002.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_iontoveho_zdroje_MALDI_a405873198/2-THETA-Schema-iontoveho-zdroje-MALDI.jpg" alt="2 THETA: Schéma iontového zdroje MALDI"/></p>
<p>Technika MALDI má celou řadu modifikací:</p>
<ul>
<li><strong>LDI</strong> (<strong>Laser Desorption/Ionization</strong>) je technika ionizace laserovým pulsem bez přítomnosti matrice, která je použitelná pro molekuly schopné absorbovat v UV oblasti (např. polycyklické aromatické uhlovodíky).</li>
<li><strong>SELDI</strong> (<strong>Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá terčíků s chemicky modifikovaným povrchem, na který jsou specifickými interakcemi vázány sledované sloučeniny. Po nanesení vzorku a jeho vysušení se terčík opláchne, čímž se odstraní nežádoucí příměsi, a po nanesení matrice následuje analýza [19].</li>
<li><strong>SALDI</strong> (<strong>Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá desorpce peptidů a proteinů laserem z grafitového povrchu [20].</li>
<li><strong>NALDI</strong> (<strong>Nanostructure-Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá k podpoře desorpce a ionizace pomocí laseru nanočástic [21].</li>
<li><strong>SPALDI</strong> (<strong>Silicon Nanoparticle Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) je variantou předchozí techniky, která využívá křemíkových nanočástic [22].</li>
<li><strong>DIOS</strong> (<strong>Desorption-Ionization on Porous Silicon</strong>) je založena na využití terčíků pokrytých porézním křemíkem [23].</li>
</ul>
<h5><strong>INDUKČNĚ VÁZANÉ PLAZMA (ICP)</strong></h5>
<p>Pro prvkovou analýzu zejména organokovových sloučenin je jako iontový zdroj využíváno indukčně vázané plazma. Vzorek ve formě aerosolu se vnáší do plazmové hlavice, ve které je ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli udržováno argonové plazma o teplotě 6 000 – 10 000 K. Do analytického kanálu plazmatu je vnášen aerosol vzorku, který je vysušen a účinně atomizován. Uvolněné atomy jsou excitovány a ionizovány; díky vlastnostem ICP dochází přednostně k ionizaci do prvního stupně.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Indukcne_vazane_plasma_3d0e1c04d7/2-THETA-Indukcne-vazane-plasma.jpg" alt="2 THETA: Indukčně vázané plasma"/></p>
<h5><strong>IONTOVÉ ZDROJE PRO PŘÍMOU ANALÝZU VZORKU</strong></h5>
<ul>
<li><p><strong>DART</strong> (<strong>Direct Analysis in Real Time</strong>) pracuje za atmosférického tlaku. K ionizaci využívá elektronicky nebo vibronicky excitované atomy helia, které jsou generovány (spolu s ionty) pomocí doutnavého výboje mezi jehlovou elektrodou a protilehlou diskovou elektrodou</p>
</li>
<li><p><strong>Desorpční elektrosprej</strong> (<strong>Desorption electrospray, DESI</strong>) [25] využívá obdobně jako MALDI destičku s terčíky, na nichž jsou naneseny vzorky.</p>
</li>
<li><p><strong>Desorpční fotoionizace za atmosférického tlaku</strong> (<strong>Desorption Atmospheric Pressure Photoionization, DAPPI</strong>) [27] je ionizační technika, při které je vzorek „ofukován“ horkými parami rozpouštědla a zároveň ozařován UV zářením.</p>
</li>
<li><p><strong>Měkká ionizace chemickou reakcí při přenosu</strong> (<strong>Soft Ionization by Chemical Reaction in Transfer, SICRIT</strong>) [28] je pravděpodobně nejnovější ambientní ionizační technikou. Vzorek je ionizován v kapiláře umístěné přímo před vstup do hmotnostního spektrometru působením dielektrického bariérového výboje generujícího studené plazma.</p>
</li>
</ul>


Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (základy, konstrukce MS)

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

2 THETA ASE, s.r.o. byla založena v roce 2000. Rozsah jejích činností zahrnuje obchod s laboratorními přístroji, vybavením laboratoří, referenčními materiály, nástroji a zařízením pro odběr a úpravu vzorků, atd. Firma také organizuje odborné a vzdělávací akce a zajišťuje pomoc při aplikacích mikrovlnné techniky ve výzkumu a výrobě. 

2 THETA ASE

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material