Organická analýza - Elektroseparační metody

Pravidelný seriál z vybraných kapitol knihy Organická analýza. Další díl patří elektroseparačním metodám.
**Foto:** 2 Theta: Organická analýza

Foto: 2 Theta: Organická analýza

8 ELEKTROSEPARAČNÍ METODY

8.1 Kapilární zónová elektroforéza a izotachoforéza
  • 8.1.1 Teoretické principy
  • 8.1.2 Konštrukcia prístrojov
    • 8.1.2.1 Zdroj prúdu (napätia)
    • 8.1.2.2 Kapiláry
    • 8.1.2.3 Detektory
  • 8.1.3 Zónová elektroforéza
  • 8.1.4 Izotachoforéza
    • 8.1.4.1 Inštrumentácia pre ITP
  • 8.1.5 Aplikácie ITP a CZE
  • 8.1.6 Epitachoforéza
    • 8.1.6.1 Princip
    • 8.1.6.2 Instrumentace
    • 8.1.6.3 Aplikace

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Elektroseparační metody

Elektroseparačné, elektromigrační alebo elektroforetické metódy sú techniky analytickej chémie určené primárne k separácii a následnej detekcii látok nesúcich elektrický náboj, buď vlastný nebo získaný interakciou s inou látkou. Môžme ich rozdeliť podľa priebehu vlastnej separácie na techniky známe pod pojmom zónová elektroforéza, izotachoforéza, izoelektrická fokusácia, elektrochromatografia a micelárna elektrokinetická chromatografia, epitachoforéza ale tiež podľa prostredia, v ktorom separácia prebieha, napr. na papieri, v géle alebo vo voľnom elektrolyte. Pri vykonávaní elektroforetických techník na nosičoch sa často stretávame i s veľmi účinnou separáciou v dvoch smeroch, 2D elektroforézou. Prepojiť je možné i techniky navzájom, napr. izotachoforézu zo zónovou elektroforézou pri diskovej elektroforéze nebo pri on-line kombinácii izotachoforézy zo zónovou elektroforézou v kapilárnom usporiadaní. Každá z techník si našla svoje uplatnenie, každá má výhody pre určitý typ analýz.

Kapilárna zónová elektroforéza, izotachoforéza a epitachoforéza

Elektroforetické (ELF) techniky majú v rámci bývalého Československa veľmi silné postavenie. Táto skutočnosť je odrazom toho, že v prakticky vo všetkých väčších mestách (Praha, Brno, Olomouc, Bratislava) sa v rámci vysoký škôl alebo akadémie vied vytvorila silná skupina vedená silnou osobnosťou (prof. Vacík, Dr., Prusík, prof. Boček, doc. Stránský, prof. Stankoviansky, prof. Kaniansky). Takýmto spôsobom celé generácie študentov dostali dobré základy, tak o kapilárnej elektroforéze, ale najmä o izotachoforéze. Československo predstavovalo špičku v tejto oblasti v celosvetovom meradle. Navyše sa prístroje pre izotachoforézu na vysokej svetovej úrovni vyrábali ako v Čechách i na Slovensku.

Teoretické princípy

Výhodou elektroforetických techník oproti chromatografickým je, že ich teoretický popis je oveľa jednoduchší. V chromatografii vstupuje do procesu oveľa viac faktorov ovplyvňujúcich separáciu najmä preto, že je viazaná na použitie jednej príp. dvoch fáz . V prospech chromatografických techník hovorí ich dlhšie používanie a následne i rozšírenie a väčšie možnosti ovplyvnenia separovaných zložiek a tým dosiahnutia optimálneho delenia. V tejto kapitole sa zameriame na možnosti využitia ELF techník v analytických laboratóriách. Elektroforetické techniky sú založené na princípe separácie látok v nemennom elektrickom poli. Podstata delenia je rozdielna pohyblivosť jednotlivých iónov v jednosmernom elektrickom poli. Pohyblivosť je definovaná ako rýchlosť častice v jednosmernom elektrickom poli.

Pohyblivosť všeobecne je závislá na niekoľkých faktoroch:
  • pH prostredia
  • schopnosť tvorenia komplexov
  • rozpúšťadlo

V elektroforéze pracujeme s pojmom tzv. efektívnej pohyblivosti, čo je pohyblivosť danej častice v reálnom prostredí.

Ak je ión v roztoku prítomný vo viacerých acidobázických a komplexných formách, ktorým prislúchajú rozdielne aktuálne pohyblivosti a tieto rovnováhy sú kineticky labilné (rýchlo sa ustaľujúce), vtedy ión migruje v jedinej zóne s výslednou pohyblivosťou odpovedajúcou aktuálnym pohyblivostiam jednotlivých foriem vo vzťahu k ich zastúpeniu v roztoku. Najčastejšie využívaným parametrom na ovplyvnenie pohyblivosti, za účelom optimalizácie delenia, je změna pH elektrolytu v ktorom prebieha separácia. Význam tohto parametra si ukážeme na príklade zmeny m ef pre kyselinu octovú, ktorá má pK 4,72 a hodnota α pri tomto pH je ca 0,5 (pomer disociovanej a nedisociovanej formy je v pomere 1:1) . Pri pH o 2 rády nižšom je táto hodnota ca 0,01 a naopak pri pH = 6,72 je ca 99 a hodnota efektívnej pohyblivosti sa prakticky rovná pohyblivosti jej plne disociovanej formy. Takýmto spôsobom je možné relatívne jednoducho optimalizovať separačné podmienky najmä vo vzorkách si zložitou matricou.

Elektroforetické techniky delíme nasledovne:
  • zónová elektroforéza
  • izotachoforéza
  • epitachoforéza
  • izoelektrická fokusácia
  • metóda pohyblivého rozhrania

Konštrukcia prístrojov

Všetky elektroforetické techniky majú v podstate rovnaké veľmi jednoduché usporiadanie prístroja. Anodický a katodický rezervoár, separačný priestor, zdroj prúdu a detektor s vyhodnotením signálu. Rozdiel je potom len v náplni týchto častí prípadne v niektorých doplnkoch k nim.

2 THETA: Schéma elektroforetického zariadenia

Zdroj prúdu, separačný priestor a detekčné zariadenia majú spoločné charakteristiky preto sa im budeme bližšie venovať v tejto spoločnej kapitole.

ZDROJ PRÚDU (NAPÄTIA)

Zdroje prúdu požívané v elektroforéze pracujú buď v režime konštantného napätia alebo konštantného prúdu. V kapilárnej zónovej elektroforéze je to zdroj konštantného napätia a naopak v izotachoforéze zdroj konštantného prúdu.

KAPILÁRY

V elektroforetických technikách používane 2 typy kapilár: kremenné a teflonové, pričom prvé z nich dominujú v kapilárnej zónovej elektroforéze a druhý typ, i keď nie tak dominantne, v izotachoforéze. Kremenné kapiláry sú pokryté vrstvou polyimidu, aby sa dosiahla výborná ich ohýbateľnosť v porovnaní s nepokrytými kapilárami, ktoré sú naopak veľmi krehké. U veľmi tenkých kapilár je polomer ohybu len niekoľko cm. Typickou vlastnosťou kremenných kapilár je vznik elektrickej dvojvrstvy na ich vnútornom povrchu.

2 THETA: Vznik elektroosmotického toku v kapiláre

Na povrchu steny sa nachádzajú silanolové skupiny SiOH, ktoré čiastočne disociujú. Tesne pri povrchu sa tak vytvorí vrstva katiónov, ktorá je trvale viazaná na povrchu kapiláry. V ďalšej vrstve je ešte stále prevaha katiónov, ktoré nie sú tak silne viazané na povrch kapiláry. Po zapnutí jednosmerného elektrického poľa sa táto vrstva pohybuje smerom ku katóde. Pretože katióny sú solvatované, strhávajú so sebou molekuly, ktoré sa nachádzajú vo vnútri kapiláry. Výsledkom je pohyb kvapaliny nazývaný elektroosmotický tok. Elektroosmotický tok začína hrať významnú rolu pri pH vyššom ako 4 a zvyšuje sa s rastúcim pH (vyššia disociácia silanolových skupín).

DETEKTORY

V CZE je najčastejšie používaným detektorom UV detektor resp. DAD detektor. Je umiestnený pred konciom kapiláry, na ktorej je vytvorené v polyimidovom pokrytí kapiláry detekčné okno, cez ktoré je vedený naprieč kapilárou svetelný lúč. Okno sa vytvorí spálením polyimidovej vrstvy pomocou cigaretového zapaľovača a následným odstránením prípadných zvyškov v metanole namočenou handričkou, Je zrejmé, že UV neabsorbujúce látky nebudú takýmto detektorom detekované. Na detekciu takýchto látok sa používa pufor s UV absorbujúcou látkou a ióny, ktoré nevykazujú absorpciu pri zvolenej vlnovej dĺžke budú vykazovať negatívny pík . Takýto spôsob detekcie sa nazýva nepriama detekcia a používa sa často v analýze anorganických aniónov, ktoré nie sú aktívne v UV oblasti [3]. V zónovej elektroforéze je šírka píkov cca 3 sekundy a preto je potrebné, aby mal detektor časovú konštantu 0.3 sekundy alebo nižšiu. Toto však neplatí pre izotachoforézu, kde sú zóny kratšie ako 1 sekunda a následne musí byť časová konštanta detektora 0,1 sec a menšia, čo niektoré detektory určené pre CZE nespĺňajú. Jedným zo spôsobov ako zlepšiť detekčný limit, je zväčšenie optickej dráhy. Je na to niekoľko spôsobov napríklad vytvorenie bubliny v mieste detekcie alebo utvorenie tzv. Z – dráhy tak, že svetelný lúč prechádza na určitom úseku pozdĺž kapiláry, v konečnom dôsledku to ale znižuje separačnú účinnosť.

Kvalitatívne vyšším stupňom detekcie je DAD detekcia, kde je možné počas prechodu zóny detektorom nasnímať celé spektrum látky. S pomocou výpočtových metód je následne možné zistiť čistotu daného píku. To sa často využíva pri kontrole čistoty farmaceutických prípravkov.

Základným typom detekcie v izotachoforéze je vodivostná detekcia. Jeho výhodou je, že je to typ univerzálneho detektora, pretože sníma veličinu, ktorá je podstatou delenia, to znamená každú separovanú zónu. V posledním čase nadobudla významnú vodivostná detekcia i v CZE, pretože sa podarilo vyvinúť dostatočne citlivý detektor i na veľmi malé priemery kapilár s ktorými sa pracuje v tejto technike.

Zónová elektroforéza

Pod pojem zónová elektroforéza zahrnujeme taktiež elektroforézu, kde separačné médium sú rôzne gély (najmä polyakrylamidový gél), ktorý sa používa zväčša v na delenie veľkých molekúl v bioaplikáciách a jej použitie v anorganickej analýze je zanedbateľné. Táto kapitola sa bude venovať len kapilárnej zónovej elektroforéze to znamená, že separačný priestor je tvorený kapilárou. Kapilárna zónová elektroforéza je charakteristická tým, že všetky časti aparatúry sú naplnené tým istým roztokom, nazývaným nosný elektrolyt.

2 THETA: Princíp zónovej elektroforézy

CZE pracuje v takzvanom otvorenom systéme, to znamená, že oba konce kapiláry sú voľne položené do roztoku. Aby sa zabránilo hydrodynamickému toku v kapiláre je potrebné dbať na to, aby hladiny v oboch elektródových nádobách boli na tej istej úrovni. Výsledkom separácie je záznam z detektora umiestneného na konci kapiláry. V prípade úplnej separácie v kapilárnej zónovej elektroforéze dostávame záznam uvedený na obrázku. Ak dôjde k úplnému rozdeleniu zmesi, tak sú jednotlivé zóny od seba oddelené roztokom nosného elektrolytu. Obdobne ako v chromatografických technikách je na osi x osi časový údaj, ktorý znamená kvalitatívnu informáciu. V elektroforéze sa nazýva migračný čas a je to čas, ktorý je potrebný na migráciu vzorky od začiatku kapiláry po okno detektora. Výška signálu z detektora na osi y je kvantitatívny údaj.

Tvar píku v CZE je závislý od hodnoty pohyblivosti iónu v zóne ku hodnote pohyblivosti nosného iónu. V prípade, že je jeho pohyblivosť nižšia ako nosného iónu pík vykazuje tvar chvostujúceho píku, v opačnom prípade dostávame opačný pík so strmou hranou na konci - frontujúci pík.

V CZE pracujeme najčastejšie s týmito puframi:

Tabulka Použitie pufrov v CZE
Pufor pracovné rozmedzie pH
  • Fosfátový 1,2 – 3,15
  • Acetátový 3,75 – 5,75
  • Fosfátový 6,20 – 8,20
  • Borátový 8,15 – 10,15

Izotachoforéza

V izotachoforéze sa, na rozdiel od kapilárnej zónovej elektroforézy, používajú 2 základné elektrolyty – vodiaci a zakončujúci. Vodiaci elektrolyt obsahuje anión (v prípade delenia aniónov), ktorého pohyblivosť je vyššia jako pohyblivosť všetkých delených aniónov zo zmesi. Vo väčšine prípadov pri delení aniónov je ním chloridový anión, pri delení katiónov amóniový alebo draselný. Okrem toho obsahuje katión (na dosiahnutie elektroneutrality), ktorý je zvyčajne súčasťou tlmiaceho roztoku – pufru. V tejto funkcii sa zvyčajne používajú aminokyseliny. Zakončujúci elektrolyt obsahuje ión, ktorého pohyblivosť je nižšia ako pohyblivosť zložiek v celej separovanej zmesi, zvyčajne nejaká veľká molekula s vysokou hodnotou pK. Do rozhrania týchto dvoch elektrolytov sa vkladá vzorka. Vzorka musí vyhovovať požiadavke, že všetky separované ióny musia mať pohyblivosti medzi vodiacim a zakončujúcim iónom. V prípade, ak zmes obsahuje ióny, ktoré sú mimo tento rozsah, tieto migrujú vo vodiacom resp. zakončujúcom elektrolyte princípom zónovej elektroforézy a nie je možné ich v daných podmienkach stanoviť. Po vložení vzorky sa vloží napätie a zóny migrujú v elektrickom poli podľa ich pohyblivostí. Po určitom čase sa dosiahne úplného rozdelenia všetkých zložiek do zón. Každá zóna obsahuje len jednu zložku a jej koncentrácia je v celej zóne rovnaká (na rozdiel od zónovej elektroforézy, kde sa predpokladá gausovský koncentračný profil) a zóny idú tesne za sebou. To znamená, že sa i vlastnosti zón na ich hranici menia skokom, čo je výhodné z hľadiska fyzikálnych metód detekcie. Vzhľadom na to, že v ITP pracujeme s konštantným prúdom zóny sa pohybujú rovnakou rýchlosťou (odtiaľ názov izotachoforéza : izo – rovnaký, tacho – rýchlosť, foréza – nesenie). Koncentrácia jednotlivých iónov v zónach je určená Kohlrauschovou regulačnou funkciou.

V ITP je jednou z najdôležitejších princípov fungovanie Kohlraushovej regulačnej funkcie, ktorá je jednou zo základných rovníc platiacich pre elektroforetické techniky. V praxi to znamená, že pri danej vzorke a danom pH pufru je koncentrácia vzorky v zóne závislá len od koncentrácie vodiaceho iónu, ktorý je volený operátorom. Celý proces ITP separácie si môžeme ilustrovať na obr níže.

2 THETA: Princíp izotachoforetického delenia s priebehom fyzikálnych veličín. T – teplota, E – intenzita el. poľa, R – elektrický odpor.

Predpokladáme zloženie vodiaceho elektrolytu QL, zakončujúceho QT a vzorky so zložkami A, B, C, pričom pre pohyblivosti platí: mL ˃ mA ˃ mB ˃ mC ˃ mT. Po zapnutí prúdu sa postupne vydeľujú zo zmesi najrýchlejšie a na konci najpomalšie ióny (t1). V prechodnom stave je na začiatku vydelená čistá zóna s najrýchlejším z iónov (A), v strede sú stále nerozdelené zložky a na konci je čiastočne vydelený najpomalší ión (C). Po určitom čase dôjde k úplnému rozdeleniu zmesi čo nazývane ustálený stav (t2). V takomto stave celá zmes prechádza konštantnou rýchlosťou detektorom, pričom priebeh jednotlivých fyzikálnych veličín je znázornený na obr. dolu. Tento stav je neustále udržovaný v rovnováhe, pretože akonáhle sa ión dostane (napr. tepelnou difúziou) do inej zóny pred sebou alebo za sebou, dostane sa do poľa, kde je nižšia resp. vyššia intenzita elektrického poľa ako prísluší jeho vlastnej zóne určenou jeho pohyblivosťou. Potom sa jeho pohyb spomalí resp. urýchli a tento stav je v neustálej dynamickej rovnováhe. Šírka rozhrania závisí hlavne od priemeru kapiláry, veľkosti prúdu a ďalších faktorov, ale zvyčajne sa pohybuje na úrovni desatín mm.

INŠTRUMENTÁCIA PRE ITP

ITP je možné principiálne realizovať i v prístrojoch určených na CZE. Táto možnosť sa využíva ojedinele a to najmä v prípadoch, keď ITP slúži ako prechodný jav v CZE na zakoncentrovanie jednotlivých zložiek. Prakticky všetky komerčne dostupné prístroje pre ITP sa výrazne odlišujú od prístrojov pre CZE. Prevažne sa používa horizontálne usporiadanie kapiláry, pretože pri vertikálnom uložení separačnej kapiláry dochádza v kapilárach s vyšším priemerom (nad 0,3mm) k výraznému vplyvu gravitačnej sily na tvar zóny (rozšírená v spodnej časti) a tým k zníženiu účinnosti. Hydrodynamickému toku v kapiláre v horizontálnom uložení je zabránené požitím membrány, ktorá je z celofánu. Celofán má jedinečnú vlastnosť, že pre elektrický prúd predstavuje zanedbateľný odpor, ale neprepúšťa kvapalinu. Dávkovanie vzorky, ktorá musí byť aplikovaná do rozhrania dvoch základných elektrolytov je realizované pomocou kohúta s pevným objemom, prípadne cez septum pomocou mikrostriekačky. Prvý spôsob je výhodný z hľadiska, že pri dávkovaní dôjde len k minimálnemu premiešavaniu vzorky a druhý, ak máme k dispozícii veľmi malý objem vzorky.

Aplikácie ITP a CZE

Hlavnou oblasťou aplikácií oboch metód je organická a bioanalytická analýza, kde je na dosiahnutie požadovaných analytických výsledkov potrebné použiť separačnú techniku. V anorganickej analýze všeobecne je prevládajúcou oblasťou analýza kovov, kde dominujú svojou rýchlosťou a citlivosťou spektroskopické techniky ako AAS, ICP, RFA, ICP-MS. ITP a CZE majú pri analýze kovov skôr doplňujúce postavenie. Vyšší počet aplikácií je pri analýze anorganických aniónov vo vzorkách. Zo separačných techník majú dominantné postavenie iónová chromatografia a elektroforetické techniky. Ich oblasť využitia sa koncentruje hlavne na analýzu aniónov. Vzhľadom na rozsah tejto knihy a význam týchto metód v anorganickej analýze uvedieme len typické analýzy jednotlivých techník. Podrobnejšie údaje možné nájsť v literatúre [7] . Separačnú schopnosť CZE je možné ilustrovať na analýze modelovej zmesi aniónov obr.

2 THETA: Záznam z CZE separácie modelovej zmesi aniónov. Koncentrácie zložiek v rozmedzí 1 – 10 ppm, kremenná kapilára 50 μm, pH = 8,0, nosný elektrolyt 5 mM chroman, nepriama UV detekcia pri 254 nm. 1 – tiosulfáty, 2 – bromidy, 3 – chloridy, 4 – sírany, 5 - dusitany, 6 – dusičnany, 7 – molybdenany, 8 – azidy, 9 – wolframany, 10 - monofluorfosforečnany, 11 – chlorečnany, 12 – citráty, 13 – fluoridy, 14 – mravčany, 15 – fosforečnany, 16 - fosforitany, 17 – chloritany, 18 – galaktarány, 19 – uhličitany, 20 – etánsulfonáty, 21 – octany, 22 – propionány, 23 – propánsulfonáty, 24 – maslany, 25 – butánsulfonáty, 26 – valerany, 27 – benzoany, 28 – glutarany, 29 – pentánsulfonáty, 30 – glukuronany. So súhlasom [3]

Najčastejšou aplikáciou ITP v praxi sú 2 metodiky. Analýza pitných, povrchových vôd a odpadných vôd, kde v jednej a analýze je možné bez predúpravy vzorky stanoviť makrozložky (dusičnany, sírany a súčasne mikrozložky (dusitany, fluoridy, fosfáty, bromičnany...), ktoré sú v pomere 2 : 100 000 [14]. Výhodou oproti iónovej chromatografii sú najmä rádovo nižšie prevádzkové náklady a pomer stanovovaných zložiek.

Druhou aplikáciou je analýza organických kyselín v rôznych vzorkách, najmä však analýza siláží a fermentačných vzoriek [44]. Tento separačný systém je možné použiť tiež s rôznymi úpravami pH na analýzu rôznych vzoriek obsahujúcich organické kyseliny jako vína, nápoje, potraviny apod. Veľkou výhodou oproti chromatografickým technikám, kde je nutné pred dávkovaním na kolónu vzorku predupraviť je, že vzorka vyžaduje len riedenie, príp. filtráciu.

2 THETA: ITP záznam analýzy siláže riedenej 200x

Na záver uvádzame stručný prehľad použitia elektroforetických techník s ohľadom na rozsahy stanovovaných koncentrácií.

2 THETA: Tabulka Prehľad elektroforetických techník s ohľadom na rozsahy stanovovaných koncentrácií

2 THETA ASE
 

Mohlo by Vás zajímat

Legionella ve vodách. Proč je testování důležité?!?!

Instrumentace
---
Výrobce
---
Zaměření
Životní prostředí

Quantifying Oligonucleotides (CONSUMABLES GUIDE BOOK)

Instrumentace
Příprava vzorků, Spotřební materiál, LC/MS, LC kolony
Výrobce
Waters
Zaměření
Farmaceutická analýza, Klinická analýza

Identification of Double Bond Positions in Butter Triacylglycerols Using DPiMS QT Kit and OAD-TOF System

Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Total acid number with conductometric titration

Instrumentace
Titrace
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Průmysl a chemie

Characterization of lipid components in lipid nanoparticle (LNP) formulations

Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Lipidomika
 

Podobné články

 

Podobné články

 

Podobné články

 

Podobné články