Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (základy, konstrukce MS)

6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

6.1 Teoretické základy

6.2 Konstrukce hmotnostního spektrometru

• 6.2.1 Ionizační techniky
  • 6.2.1.1 Elektronová ionizace (EI)
  • 6.2.1.2 Chemická ionizace (CI)
  • 6.2.1.3 Elektrosprej
  • 6.2.1.4 Chemická ionizace za atmosférického tlaku
  • 6.2.1.5 Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)
  • 6.2.1.6 MALDI
  • 6.2.1.7 Indukčně vázané plazma (ICP)
  • 6.2.1.8 Iontové zdroje pro přímou analýzu vzorku

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Teoretické základy

Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda založená na interakci iontů s elektrickým, případně magnetickým polem. Pojmem „pole“ (případně „fyzikální pole“) se rozumí oblast v prostoru, která silově působí na specie schopné s tímto polem interagovat.

Elektrické pole je vytvářeno elektricky nabitým tělesem. Podle závislosti na čase lze definovat nestacionární (časově proměnné) a stacionární (časově neměnné) elektrické pole. Tvar elektrického pole (a tedy i směr působení síly) je popisován siločárami, které vycházejí z kladné elektrody a vstupují do záporné, přičemž tečny v jednotlivých bodech ukazují směr působení elektrického pole. Dvěma základními tvary jsou homogenní (siločáry probíhají rovnoběžně) a radiální elektrické pole (siločáry vycházejí z jednoho bodu nebo do něj vstupují). V hmotnostní spektrometrii se využívá homogenní elektrostatické pole, které je vytvářeno vkládáním stejnosměrného napětí na dvě deskové elektrody, které mohou být rovinné nebo zakřivené. V tomto případě bývá elektrostatické pole stacionární. Nestacionární elektrické pole se využívá v analyzátorech s tyčovými nebo prstencovými elektrodami.

Magnetické pole je vyvoláno pohybujícím se elektrickým nábojem (tedy elektrickým proudem), lze jej tedy pozorovat okolo elektrických vodičů. Orientaci siločar magnetického pole v okolí přímého vodiče určuje Ampérovo pravidlo pravé ruky: položíme-li ruku na vodič tak, že palec ukazuje směr protékajícího proudu (od kladného pólu k zápornému), pak zahnuté prsty ukazují orientaci siločar magnetického pole. U permanentních magnetů je magnetické pole vytvářeno tzv. vázanými elektrickými proudy. V hmotnostní spektrometrii je magnetické pole generováno pomocí elektromagnetů tvořených cívkou. Pro zesílení je do cívky vkládáno jádro z magneticky měkkého materiálu (magnetický efekt vykazuje pouze při průchodu proudu).

Konstrukce hmotnostního spektrometru

Základní části hmotnostního spektrometru jsou:

• (i) iontový zdroj, sloužící k převedení neutrálních molekul na ionty;
• (ii) analyzátor, sloužící k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z);
• (iii) detektor převádějící intenzitu jednotlivých fragmentů na elektrický signál;
• (iv) vakuový systém, udržující ve spektrometru požadovanou úroveň vakua, podle typu analyzátoru 10¯³ až 10¯¹¹ Pa;
• (v) systém pro řízení hmotnostního spektrometru a pro sběr a zpracování naměřených dat.

Ionizační techniky

Základním předpokladem úspěchu hmotnostně spektrometrického experimentů je úspěšná ionizace vzorku. První ionizační technikou v hmotnostní spektrometrii, dnes už nevyužívanou, byl elektrický výboj v plynech [1]. Během vývoje byla ionizačním technikám věnována značná pozornost a postupně byla navržena řada různých uspořádání, z nichž pouze malá část se v současnosti využívá. Ty budou v následujícím textu podrobněji popsány. V organické hmotnostní spektrometrii lze ionizovat vzorky ve všech třech skupenstvích. Pro plynné vzorky se nejčastěji využívá elektronová ionizace (EI, Electron Ionization), případně ionizace chemická (CI, Chemical Ionization). Pro vzorky kapalné jsou využívány tzv. sprejovací techniky za atmosférického stavu: elektrosprej (ESI, Electrospray Ionization), chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization) a fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI, Atmospheric Pressure Photoionization). Pro vzorky pevné je nejdůležitější ionizační technikou MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization). Pro prvkovou analýzu organických i organokovových sloučenin je pak využívána ionizace pomocí indukčně vázaného plazmatu (ICP).

ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI)

Tato technika je podle starší terminologie označována jako „ionizace nárazem elektronu“ (Electron Impact Ionization). Poprvé ji popsal H. D. Smyth roku 1922 jako metodu pro určování ionizačních potenciálů látek [2], ale záhy ji použil pro ionizaci plynných prvků – např. dusíku [3], vodíku [4], oxidu uhličitého [5] a řady dalších. Principem je interakce elektronů urychlených na kinetickou energii 70 eV s neutrálními molekulami, při které dochází k vyražení elektronu z elektronového obalu molekuly za vzniku radikálkationtu, označovaného též jako molekulový ion:

M + 𝑒⁻ → M⁻▪ + 2 𝑒⁻

Nadbytek energie předaný při interakci (ionizační energie organických sloučenin se nejčastěji pohybuje v rozmezí 8–14 eV) pak vede k fragmentaci molekulového iontu za vzniku nabitých fragmentů F (nejčastěji se sudým počtem elektronů) a neutrálních ztrát N (nejčastěji ve formě radikálů):

M⁻▪ → F₁ + N₁▪ + F₂ + N₂▪ + ...

Vzhledem k velkému množství energie předávanému ionizované spécii při interakci s ionizujícím elektronem je elektronová ionizace označována jako tvrdá ionizační technika. Při EI jsou produkovány pouze kationty.

2 THETA: Schéma iontového zdroje při elektronové ionizaci. Vzorek je přiváděn kolmo k směru ionizujících elektronů (kolmo na plochu papíru)

Schéma iontového zdroje pro elektronovou ionizaci je uvedeno výše. Elektrony jsou emitovány ze žhaveného vlákna nazývaného filament (česky vlákno), a jsou přitahovány k protilehlé elektrodě označované jako trap (česky lapáček). Elektrické pole jim uděluje kinetickou energii 70 eV (1 eV = 1,602.10¯¹⁹J). Permanentní magnet přispívá k prodloužení dráhy letu ionizujících elektronů tím, že z přímé trajektorie vytváří šroubovici, a tím zvyšuje pravděpodobnost jejich interakce s neutrální molekulou. Elektroda označovaná jako repeler (vytěsňovací elektroda) pak slouží k vypuzení vzniklých iontů směrem k analyzátoru. V iontovém zdroji je udržováno vakuum na úrovni 10¯³ Pa, čímž se zabrání kolizím vzniklých iontů, ať již mezi sebou nebo s neutrálními molekulami.

Fragmentace při energii ionizujících elektronů 70 eV je reprodukovatelná. Díky tomu má elektronová ionizace jedinečnou výhodu, kterou je možnost vytváření rozsáhlých knihoven hmotnostních spekter (obsahujících dnes přes půl milionu záznamů). Neznámou sloučeninu lze pak identifikovat porovnáním experimentálního spektra s knihovnou. Další výhodou je velmi dobrá znalost fragmentačních mechanismů jednotlivých tříd sloučenin [6], umožňující vyřešení struktury analyzované sloučeniny v případě selhání identifikace pomocí knihovny. Nevýhodou elektronové ionizace je omezená použitelnost pouze pro těkavé a termostabilní sloučeniny, a v některých případech i malá intenzita nebo úplná absence molekulárního iontu nesoucího informaci o molekulové hmotnosti analyzované sloučeniny.

CHEMICKÁ IONIZACE (CI)

Chemická ionizace byla poprvé popsána roku 1966 Munsonem a Fieldem [7], jevy související s touto technikou byly však pozorovány podstatně dříve. Již roku 1916 pozoroval Dempster v hmotnostním spektru vodíku pík s m/z = 3, který vysvětlil jako H⁺₃ [8]. Roku 1952 sovětský vědec Viktor Lvovič Talrose pozoroval ve spektru methanu neobvykle intenzivní ion s m/z = 17 a objasnil jeho vznik ion-molekulární reakcí radikálkationtu a neutrální molekuly methanu [9]:

CH₄⁺▪ + CH₄ → CH₅⁺ + CH₃▪

Výše uvedené jevy byly způsobeny nedostatečně kvalitním vakuem v iontovém zdroji, kdy docházelo ke kolizím vzniklých iontů s neutrálními molekulami. Tento princip byl pak využit při chemické ionizaci, kdy v prvním kroku je elektronovou ionizací ionizován reakční plyn (např. methan, isobutan, amoniak), kterého je v iontovém zdroji výrazně více než analyzované látky (v poměru cca 10⁴:1). Tlak v iontovém zdroji je v důsledku nátoku reakčního plynu podstatně vyšší než při elektronové ionizaci (obvykle v rozmezí 10–100 Pa), takže ion-molekulárními reakcemi dochází ke vzniku reaktivních spécií.

ELEKTROSPREJ

Elektrosprej je hodnocen jako jedna z nejvýznamnějších ionizačních technik posledního období. V podstatě se nejedná o ionizační techniku v pravém slova smyslu, ale o metodu převodu iontů z kapalné do plynné fáze. Tato technika byla ve funkci hmotnostně spektrometrického iontového zdroje poprvé využita roku 1968, kdy Malcolm Dole takto úspěšně analyzoval polystyren s molekulovou hmotností přesahující 50 kDa [10]. Pro analýzu organických látek byl elektrosprej poprvé využit roku 1984 [11], rok poté byla tato technika využita pro sekvenování peptidů [12]. Významným mezníkem ve využití elektrospreje bylo objevení jeho schopnosti mnohonásobně nabíjet biopolymery (peptidy, proteiny a další), což umožnilo analyzovat makromolekuly na přístrojích se standardním hmotnostním rozsahem [13]. Za tento objev obdržel jeho autor John B. Fenn roku 2002 Nobelovu cenu za chemii.

2 THETA: Schéma elektrospreje

Schéma klasického elektrospreje je uvedeno na výše. Vzorek je přiváděn do sprejovací kapiláry (zpravidla nerezové), na kterou je vkládáno vysoké napětí (typicky 4 kV); protielektrodou je vstup do hmotnostního spektrometru. Působením elektrostatických sil dojde k vytvoření tzv. Taylorova kužele, z jehož vrcholku jsou sprejovány mnohonásobně nabité kapénky roztoku vzorku. Odpařováním rozpouštědla v důsledku zvýšené teploty ve sprejovacím prostoru (zpravidla je využíván sušící plyn s teplotou nad 300 °C) dochází ke zmenšování kapének, což vede ke zvyšování odpudivých sil mezi souhlasně nabitými molekulami vzorku. Proti těmto silám působí povrchové napětí kapaliny, které se snaží udržet kapénku vcelku. Mez, kdy se tyto síly vyrovnají, je označována jako Rayleighův limit. Po jeho překročení dochází k tzv. Coulombické explozi, kdy se kapénka rozpadne na řadu menších, a proces se opakuje až do uvolnění individuálních iontů

Sprejování pomocí elektrostatického pole se využívá v nanoelektrospreji, kde jsou velmi nízké průtoky (jednotky až stovky nL/min). Při spojení s kapalinovou chromatografií, kde průtok mobilní fáze je podstatně vyšší, je zapotřebí použít podpůrného sprejovacího mechanismu, kterým je dnes nejčastěji pneumatické zmlžování, kdy zmlžovací plyn (nejčastěji dusík) se přivádí kapilárou soustředně umístěnou vně kapiláry sprejovací. Někdy se pro pneumaticky podporovaný elektrosprej používá označení „ionspray“,

2 THETA: Pneumaticky podporovaný elektrosprej (Ionspray) – boční průřez

CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU

Tuto ionizační techniku poprvé použil E.C. Horning v roce 1974 [15]. Schéma tohoto iontového zdroje je uvedeno na níže. Vzorek je pneumaticky zmlžován do vyhřívané odpařovací komůrky, páry rozpouštědla a analyzovaných látek jsou vedeny do prostoru koronového výboje vytvářeného napětím vkládaným mezi koronovou jehlu a vstupní kapiláru. Zde dochází k ionizaci par rozpouštědla (které jsou ve velkém přebytku), a vzniklé reaktivní produkty pak ion-molekulárními reakcemi ionizují molekuly analyzovaných látek.

2 THETA: Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)

FOTOIONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APPI)

Tato technika byla poprvé popsán roku 2000 [16]. Konstrukčně je tento iontový zdroj prakticky shodný s APCI, pouze namísto koronové jehly je zde umístěn zdroj UV-záření, jehož fotony poskytují energii pro ionizaci.

2 THETA: Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)

MALDI

Technika MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, desorpce/ionizace laserem za účasti matrice) ionizuje z pevného stavu. Je vhodná pro ionizaci makromolekul – biopolymerů i syntetických polymerů s molekulovou hmotností přesahující 1 MDa. Tato technika byla poprvé publikována v roce 1988; Koichi Tanaka se spolupracovníky využili kapalné matrice – glycerínu s ultrajemným práškovým kobaltem [17], zatímco Karas s Hillenkampem použili jako matrice pevnou látku – kyselinu nikotinovou [18]. Tanaka byl za objev MALDI oceněn jednou čtvrtinou Nobelovy ceny za chemii v roce 2002.

2 THETA: Schéma iontového zdroje MALDI

Technika MALDI má celou řadu modifikací:

• LDI (Laser Desorption/Ionization) je technika ionizace laserovým pulsem bez přítomnosti matrice, která je použitelná pro molekuly schopné absorbovat v UV oblasti (např. polycyklické aromatické uhlovodíky).
• SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) využívá terčíků s chemicky modifikovaným povrchem, na který jsou specifickými interakcemi vázány sledované sloučeniny. Po nanesení vzorku a jeho vysušení se terčík opláchne, čímž se odstraní nežádoucí příměsi, a po nanesení matrice následuje analýza [19].
• SALDI (Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization) využívá desorpce peptidů a proteinů laserem z grafitového povrchu [20].
• NALDI (Nanostructure-Assisted Laser Desorption/Ionization) využívá k podpoře desorpce a ionizace pomocí laseru nanočástic [21].
• SPALDI (Silicon Nanoparticle Assisted Laser Desorption/Ionization) je variantou předchozí techniky, která využívá křemíkových nanočástic [22].
• DIOS (Desorption-Ionization on Porous Silicon) je založena na využití terčíků pokrytých porézním křemíkem [23].

INDUKČNĚ VÁZANÉ PLAZMA (ICP)

Pro prvkovou analýzu zejména organokovových sloučenin je jako iontový zdroj využíváno indukčně vázané plazma. Vzorek ve formě aerosolu se vnáší do plazmové hlavice, ve které je ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli udržováno argonové plazma o teplotě 6 000 – 10 000 K. Do analytického kanálu plazmatu je vnášen aerosol vzorku, který je vysušen a účinně atomizován. Uvolněné atomy jsou excitovány a ionizovány; díky vlastnostem ICP dochází přednostně k ionizaci do prvního stupně.

2 THETA: Indukčně vázané plasma

IONTOVÉ ZDROJE PRO PŘÍMOU ANALÝZU VZORKU

• DART (Direct Analysis in Real Time) pracuje za atmosférického tlaku. K ionizaci využívá elektronicky nebo vibronicky excitované atomy helia, které jsou generovány (spolu s ionty) pomocí doutnavého výboje mezi jehlovou elektrodou a protilehlou diskovou elektrodou

• Desorpční elektrosprej (Desorption electrospray, DESI) [25] využívá obdobně jako MALDI destičku s terčíky, na nichž jsou naneseny vzorky.

• Desorpční fotoionizace za atmosférického tlaku (Desorption Atmospheric Pressure Photoionization, DAPPI) [27] je ionizační technika, při které je vzorek „ofukován“ horkými parami rozpouštědla a zároveň ozařován UV zářením.

• Měkká ionizace chemickou reakcí při přenosu (Soft Ionization by Chemical Reaction in Transfer, SICRIT) [28] je pravděpodobně nejnovější ambientní ionizační technikou. Vzorek je ionizován v kapiláře umístěné přímo před vstup do hmotnostního spektrometru působením dielektrického bariérového výboje generujícího studené plazma.