Organická analýza - Elektroseparační metody (ACE)
8.2 Afinitní kapilární elektroforéza
- 8.2.1 Úvod
- 8.2.2 Princip ACE
- 8.2.3 Vyhodnocení naměřených dat – Scatchardův graf
- 8.2.4 Techniky ACE
- 8.2.4.1 Analýza rovnovážných směsí
- 8.2.4.2 Analýza založená na změně elektroforetických mobilit
- 8.2.4.3 ACE s imobilizovaným ligandem
- 8.2.5 Aplikace ACE
- 8.2.6 Závěr
Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.
💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.
Afinitní kapilární elektroforéza
Úvod
Afinitní kapilární elektroforéza (ACE) zahrnuje kapilárně elektroforetické metody dělení látek, u kterých se v určité míře uplatňují selektivní, popřípadě i neselektivní interakce, například interakce léčiv (ligandů) s proteiny (receptory) nebo jinými makromolekulárními látkami [1]. Tyto interakce se mohou uplatňovat jak mimo separační kapiláru (např. po smíchání látek tvořících komplex v reakční viálce), tak přímo během separace v separační kapiláře. Nezbytným předpokladem je účinné oddělení volných a vázaných forem interagujících látek, čehož je dosaženo díky vysoké účinnosti a vysoké rozlišovací schopnosti kapilární elektroforézy. Výhodou ACE oproti klasické gelové elektroforéze je to, že se většinou používá separační elektrolyt (BGE), který nezpůsobuje denaturaci molekul a jeho složení se blíží fyziologickým roztokům. Nedochází tak k významnému ovlivnění přirozených rovnováh v systému [2]. ACE lze využít především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami (například interakce léčiv s proteiny, antigenů s protilátkami atd.), výpočet vazebných konstant a vazebných energií, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje proteinů atd.
Princip ACE
Kapilární elektroforéza (CE) využívá dělení látek v elektrickém poli na základě jejich rozdílné velikosti a náboje [3]. V případě, kdy jsou v roztoku přítomny látky R a L (například protein a léčivo), mající rozdílné elektroforetické mobility a tvořící spolu komplex R-L, dochází v průběhu separace k ovlivnění migračních časů jednotlivých látek. Vhodnou volbou separačního systému a podmínek ACE je možné měřit jejich vzájemnou interakci právě na základě změn migračních časů. Příklad interakce receptor-ligand je schematicky znázorněn na Obr. níže. V nepřítomnosti ligandu, L, migruje zóna molekul receptoru, R (např. protein) v separační kapiláře určitou rychlostí (µR) a její migrační čas odpovídá času tR. V přítomnosti ligandu, který s molekulou receptoru interaguje, dochází k ovlivnění migrační rychlosti zóny analytu a jejímu zpomalování, v závislosti na koncentračním poměru R a L. V případě vysycení koncentračních poměrů a vytvoření komplexu R-L budou migrační rychlost a migrační čas odpovídat μR-Lmax a tR-Lmax.
2 THETA: Obr. Vliv interakce receptor-ligand na migrační čas receptoru a vzniklého komplexu
Techniky ACE
Z praktického hlediska rozlišujeme tři uspořádání, ve kterých je možné ACE provádět [7]. Pokud dochází k interakci v kapalné fázi, jedná se o ACE v homogenním roztoku. Pokud je jedna z interagujích složek imobilizována na stěnách kapiláry, případně na nosiči, jedná se o ACE s imobilizovaným ligandem. Obr 8.20 Rozdělení technik ACE. Techniky ACE prováděné v homogenním roztoku jsou poměrně rozšířené, vzhledem k jejich jednoduchosti, malé spotřebě vzorků (analytů) a jednoduchém vyhodnocení. Jsou použitelné za předpokladu, že dochází k dostatečné separaci volných složek od vznikajících komplexů. V závislosti na stabilitě vzniklého komplexu lze použít buď Analýzu rovnovážných směsí nebo Analýzu založenou na změně elektroforetických mobilit. Na druhou stranu, techniky ACE využívající imobilizace ligandu nebo receptoru na stěny kapiláry nebo na pevném nosiči (kapilární gelová afinitní elektroforéza, kapilární afinitní elektrochromatografie) jsou používány méně často, protože kromě některých výhod (maximální účinnost interakcí) mají také některé nevýhody jako obtížná detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížná regenerace povrchu s navázaným ligandem.
2 THETA: Obr. Rozdělení technik ACE
ANALÝZA ROVNOVÁŽNÝCH SMĚSÍ
Toto uspořádání je vhodné pro systémy s pomalou kinetikou (obvykle stabilní interakce s vysokou afinitou receptor-ligand), u kterých lze jak vzniklý komplex, tak jednotlivé formy interagujícíh látek detekovat pomocí standardních detekčních metod (UV-VIS, LIF). Nutnou podmínkou je dostatečná separace jednotlivých složek směsi (ligand, receptor, komplex) a stabilita vzniklého komplexu. Při splnění podmínky tvorby stabilního komplexu se reakce provádí mimo separační kapiláru a CE slouží pouze k oddělení složek směsi. V praxi se postupuje tak, že jsou receptor a ligand nejprve smíchány v reakční viálce. Postupně se připraví několik směsí s různými koncentracemi látek a všechny tyto směsi se postupně analyzují pomocí CE.
2 THETA Obr. Schéma postupu analýzy rovnovážných směsí. Receptor a ligand jsou smíchány mimo separační kapiláru, vzniklý komplex s nezreagovanými analyty je nadávkován na separační kapiláru a složky směsi analyzovány.
Separační kapilára je naplněna separačním elektrolytem (BGE) bez přídavku receptoru nebo ligandu. Během analýzy dochází k elektromigračnímu oddělení zón receptoru, ligandu a vzniklého komplexu, které jsou detekovány ve formě píků. Plocha píků odpovídá koncentraci jednotlivých složek (je nutno předem provést kalibraci). Pokud je komplex dostatečně stabilní a CE analýza rychlá, nedochází v průběhu separace ke znatelnému rozpadu komplexu. I když k takovému rozpadu komplexu během CE analýzy dojde, koncentrace původních látek (ligand, receptor) se během analýzy nemění, protože jsou od komplexu separovány.
Kontinuální frontální analýza
Kontinuální frontální analýza [8] představuje variantu předchozí techniky analýzy rovnovážných směsí. Separační kapilára je také v tomto případě naplněna BGE bez přídavku receptoru a ligandu. Metodu lze použít pouze u reakcí s pomalou kinetikou a je opět potřeba splnit podmínku, že disociace vzniklého komplexu musí být pomalejší než doba analýzy.
2 THETA: Obr. Schéma provedení kontinuální frontální analýzy, záznam z detektoru
Metoda částečného plnění
V tomto uspořádání je kapilára opět naplněna separačním elektrolytem a postupně se nadávkuje malý objem roztoku obsahujícího ligand a roztoku obsahující receptor a dva markery. Oba nadávkované vzorky jsou od sebe odděleny separačním elektrolytem. Markery slouží pro korekci migračního času receptoru, který může být ovlivněn například změnou EOF apod.
2 THETA: Obr. Metoda částečného plnění
ANALÝZA ZALOŽENÁ NA ZMĚNĚ ELEKTROFORETICKÝCH MOBILIT
V tomto uspořádání je receptor (nebo ligand) přidán do separačního elektrolytu (BGE). Většinou se volí separační systém tak, aby větší molekula (např. receptor/protein) byla přidána do BGE a menší, interagující látka (ligand/léčivo) se nadávkuje do separační kapiláry. V důsledku interakce ligandu s receptorem přítomným v BGE dochází ke změně migračního času ligandu, a to právě v závislosti na koncentraci receptoru v BGE. Toto uspořádání je vhodné použít pro systémy, kdy je vytvořený komplex málo stabilní (afinita R-L je nízká), ale kinetika tvorby komplexu je rychlá.
Metoda Hummel-Dreyerova
Hummel-Dreyerova metoda v ACE (původně vyvinutá v roce 1962 pro analýzu gelovou chromatografií) spočívá v provedení série analýz, kdy je kapilára naplněna BGE s měnící se koncentrací nízkomolekulárního ligandu (L) a dávkuje se malé množství receptoru(R).
Vakantní metoda
Metoda vyvinutá v roce 1997 [11] spočívá v naplnění kapiláry BGE, receptorem a ligandem. Provede se série analýz se stálou koncentrací receptoru (R) a měnící se koncentrací ligandu (L). Přítomnost receptoru a ligandu způsobuje vysokou absorbanci BGE. Dávkuje se malé množství BGE neobsahující ani L ani R.
ACE S IMOBILIZOVANÝM LIGANDEM
V tomto uspořádání je ligand imobilizován na stěnu separační kapiláry nebo na nosič (částice, polymerní materiály). Molekuly receptoru přítomné v roztoku se při průchodu separační kapilárou navážou na imobilizovaný ligand. V závislosti na afinitě vůči imobilizovanému ligandu dochází ke zpomalování molekul receptoru, zatímco neinteragující látky migrují bez změny rychlosti. Porovnáním pohyblivosti jednotlivých látek v systému bez ligandu lze určit, které molekuly mají afinitu k použitému ligandu a ze stupně retardace a koncentrace imobilizovaného ligandu lze stanovit též disociační konstantu komplexu separovaná látka - ligand. Tato technika je ale v praxi méně používaná, z důvodu obtížné detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížné regenerace povrchu s navázaným ligandem. Využívá se však například pro specifický záchyt a obohacení vybraných látek (receptorů).
2 THETA: Obr. Technika ACE s imobilizovaným ligandem
Aplikace ACE
ACE nachází využití především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami, dále k výpočtu vazebných energií, stanovení vazebných konstant, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje protein atd. Hlavní uplatnění nachází ACE při studiu interakcí léčiv (léčivo-protein, léčivo glycoprotein, interakce antibiotik, DNA), studiu interakcí typu enzym—inhibitor, enzym-substrát, antigen-protilátka, hormon-receptor, lektin-sacharid, atd. Významné jsou studie například z hlediska farmakologického, protože umožňují sledovat například účinnost nasazené léčby, monitorovat koncentraci aktivní formy léčiva (volné, vázané) v biologických tekutinách a studium selektivních biologických procesů. Využití ACE bylo shrnuto v několika nedávných přehledných článcích [7, 12, 13]. Vybrané příklady studovaných interakcí jsou shrnuty v Tabulce níže.
Tabulka: Příklady studovaných interakcí
- Studovaná interakce / Technika
- Interakce HSA s léčivy (warfarin, antihistaminy, Hg, chloroquine, atd.) / ACE, FACE
- Interakce BSA s léčivy / ACE
- Interakce proteinů s heparinem / ACE
- Interakce protilátka-antigen / ACE
- Interakce proteinů s malými molekulami / ACE, PFACE
- Interakce proteinů s kovy / ACE
- Interakce polymer-polymer / ACE
- Interakce DNA-polymer / ACE
- Interakce cyklodextrinů s malými molekulami / ACE
Závěr
ACE je vysoce účinná separační metoda vhodná ke studiu interakcí, především ke stanovení disociačních a vazebných konstant a stechiometrie reakcí. Její výhodou je vysoké rozlišení, krátká doba analýzy (vhodné pro méně stabilní rovnováhy) a malá spotřeba vzorku spojená s nízkými náklady na celkovou analýzu. Výhodou je také možnost simultánního stanovení více látek v jedné analýze a studium jejich interakce se stejným ligandem. ACE je vhodnou komplementární technikou k afinitní HPLC a dalším technikám (ELISA, radioimunologické metody, NMR, gelová elektroforéza atd.), které se používají ke studiu interakcí látek. Lze očekávat, že s rozvojem kapilárně elektroforetických metod si ACE zachová statut významné techniky vhodné k určování struktury a interakcí biologicky aktivních látek. Vývoj nových technologií (mikročipová elektroforéza, vtištěné polymery, monolytické nosiče) a vývoj citlivých detekčních metod bude mít pro využití aplikačního potenciálu ACE v budoucnosti velký význam.
- [1] Heegard, N.H., Kennedy, R.T., Electrohoresis, 1999, 20, 3122-3133.
- [2] Guilt-van Duijn, R.M., Frank, J., van Dedem, G.W.K., Baltussen, E., Electrophoresis, 2000, 21, 3905-3918.
- [3] Foret, F., Křivánková, L., Boček, P.: Capillary Zone Electrophoresis. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1993.
- [4] Shimura, K. Kasai, K. Anal. Biochem. 1997, 251, 1-xx
- [5] Heegard, N.H.H., Nilsson, S., Guzman, N.A., J. Chromatogr. B, 1998, 715, 29-xx
- [6] Pacaková, V., Štulik, K., Hubená, S., Tichá, M., Chem. Listy, 2000, 94, 97-104.
- [7] Liu, X., Dahdouh, F., Salgado, M., Gomez, F.A., J. Pharmaceutical Sci. 2009,98,394-410
- [8] Gao, J.Y., Dubin, P.L., Muhoberac, B.B., Anal. Chem. 1997,69, 2945-2951.
- [9] Mito, E. Gomez, F.A., Chromatographia 1999, 50, 689-694.
- [10] Villareal, V., et al., Anal, Bioanal. Chem. 2003, 376, 822-831.
- [11] Busch, M.H.A., Boelns, H.F.M., Kraak, J.C., Poppe,H., J. Chromatogr. A 1997, 775, 313-326.
- [12] Zaveleta, J. Chinchilla, D., Brown, A., Sogomonyan, T., Ramirez, A, Calderon, V., Gomez, F.A., Curr. Anal. Chem. 2006, 2, 35-42
- [13] Neubert, R.H.H., Ruttinger, H.-H., Affinity capillary electrophoresis in pharmaceutics and biopharmaceutics, Marcel-Dekker Inc. 2003
- [14] Yung J., Hage D. S.: Anal. Chem. 66, 2719 (1994).
- [15] Lloyd D. K., Li S., Ryan P.: J. Chromatogr. A 694, 285 (1995).
- [16] Huang Y, Pan W, Guo M, Yao S. 2007. J Chromatogr A 1154:373–378.
- [17] Martinez-Gomez MA, Carril-Aviles MM, Sagrado S,Villanueva-Camanas RM, Medina-Hernandez MJ. 2007. J Chromatogr A 1147:261–269.
- [18] Gomez F. A., Avila L. Z., Chu Y.-H., Whitesides G. M.: Anal. Chem. 66, 1785 (1994).
- [19] Barker G. E., Rosso P., Hartwick R. A.: Anal. Chem. 64, 3024 (1992).
- [20] Shcharbin D, Janicka M, Wasiak M, Palecz B, Przybyszewska M, Zaborski M, Bryszewska M. 2007. Serum albumins have five sites for binding of cationic dencrimers. Biochim Biophys Acta 1774:946–951.
- [21] Liu J., Abid A., Hail M. E., Lee M. S., Hangeland L., Zein N.: Analyst 123, 1455 (1998).
- [22] VanderNoot V. A., Hileman R. E., Dordick J. S., Linhardt R. J.: Electrophoresis 19, 437 (1998).
- [23] Heegaard N. H. H., Mortensen H. D., Roepstorff P.: J. Chromatogr. A 717, 83 (1995).
- [24] Heegaard N. H. H., Brimmes J.: Electrophoresis 17, 1916(1996).
- [25] BuschM. H. A., Boelens H. F. M., Kraak J. C., Poppe H., Meekel A. A. P., Resmini M.: J. Chromatogr. 774, 195 (1996).
- [26] Lin S., Hsiao I. Y., Hsu S. M.: Anal. Biochem. 254, 9 (1997).
- [27] Phillips T. M., Chmielinska J. J.: Biomed. Chromatogr. 8, 242 (1994).
- [28] Ramirez A, Gomez FA. 2007. J Cap Elec Microchip Tech 10:43–50.
- [29] Egholm M., Buchardt O., Christensen L., Behrens C.,Freier S. M., Driver D. A., Berg R. H., Kim S. K., Nordenm,B., Nielsen P. E.: Nature 365, 566 (1993).
- [30] Hashidzume A, Watanabe S-I, Morishima Y. 2007.Langmuir 23:2191–2197. 217
- [31] Pouliquen G, Amiel C, Tribet C. 2007. J Phys Chem B 111:5587–5595.
- [32] Khoukh S, Oda R, Labrot Th, Perrin P, Tribet C.2007. Langmuir 23:94–104.
- [33] Han A, Inoue A, Hosokawa K, Maeda M. 2007. Anal Biochem 371:124–126.
- [34] Kanayama N, Takarada T, Kimura A, Shibata H,Maeda M. 2007. Reac Func Poly67:1373–1380.
- [35] Francois Y, Varenne A, Sirieix-Plenet J, GareilP. 2007. J Sep Sci 30:751–760.
- [36] Terekhova IV, Scriba GKE. 2007. J Pharm Biomed Anal 45:688–693.
