Použití přenosného systému pro snadné monitorování fermentace

In-situ měření kyseliny mléčné v pivu pomocí sítotiskových elektrod (SPE)

Kyselina mléčná (kyselina 2-hydroxypropanoová) se vyskytuje především v kysaných mléčných výrobcích. V pivu přispívá k jeho kyselosti a mléčnému aromatu a obvykle vzniká v důsledku fermentace mléčnými bakteriemi. Tyto bakterie mohou být do mladiny cíleně přidány, nebo se mohou objevit jako důsledek kontaminace.

Ačkoli je kyselina mléčná v určitém množství pro pivo žádoucí, její nadbytek je považován za senzorickou vadu. Její práh vnímání činí 0,0044 mol/l. V některých pivech typu lambic však může koncentrace kyseliny mléčné přesáhnout 0,0333 mol/l.

Tato aplikační poznámka popisuje použití enzymatického senzoru založeného na sítotiskové elektrodě k měření kyseliny mléčné v komerčních pivech jako důkaz koncepce pro možné využití při monitorování fermentace.

PŘÍSTROJE A SOFTWARE

Měření byla prováděna pomocí konektorů DROPSTATPLUS a CASTDIR pro sítotiskové elektrody (Obrázek 1).

Jako biosenzorický substrát byly použity sítotiskové elektrody na bázi L-laktátoxidázy (LACT10) díky své selektivitě. Analytický signál odpovídá detekci meziproduktu – peroxidu vodíku. Tento vedlejší produkt vzniká při přeměně laktátu na kyselinu pyrohroznovou v důsledku enzymatické reakce, která probíhá na pracovní elektrodě.

DROPSTATPLUS je elektrochemický čtecí přístroj na bázi potenciostatu, který lze nakonfigurovat podle specifických požadavků jednotlivých uživatelů. Zadáním elektrochemické techniky, jejích parametrů a kalibrační křivky může jeden přístroj automaticky zobrazovat koncentraci analytu, pro nějž byl elektrochemický senzor vyvinut, přímo na displeji LCD. Veškeré hardwarové vybavení použité v této studii je uvedeno v Tabulce 1.

Metrohm: Použití přenosného samostatného systému pro snadné monitorování fermentace: Obrázek 1. Přístroj DROPSTATPLUS a CASTDIR používaný k připojení sítotiskových elektrod.

Tabulka 1. Přehled hardwarového a softwarového vybavení.

• Přístroj: DROPSTATPLUS
• Biosenzorová SPE: LACT10
• Konektor pro SPE: CASTDIR

DETEKCE KYSELINY MLÉČNÉ

Jako analytická technika byla v tomto případě zvolena amperometrická detekce. Aplikací potenciálu –0,1 V je možné změřit koncentraci kyseliny mléčné za méně než 75 sekund, protože proudový signál rychle dosáhne ustálené hodnoty. Použití takto nízkého potenciálu je umožněno díky přítomnosti mediátoru a je klíčové pro eliminaci typických rušivých signálů, které se běžně objevují při vyšších potenciálech [1].

Pouhým nanesením kapky vzorku na elektrodu LACT10 lze stanovit koncentraci kyseliny mléčné v rozmezí 0 až 0,0004 mol/l. Typická kalibrační křivka získaná z trojího měření je znázorněna na Obrázku 2. Výsledky byly získány ve vodném roztoku 0,1 mol/l Tris-NO₃ při pH 7,2, kde se kyselina mléčná vyskytuje výhradně ve své disociované formě — tedy jako laktát, nikoli jako nedisociovaná kyselina mléčná.

Metrohm: Použití přenosného samostatného systému pro snadné monitorování fermentace: Obrázek 2. Typická kalibrační křivka získaná pomocí standardních roztoků laktátu v rozmezí 0–0,0004 mol/l ve vodném roztoku 0,1 mol/l Tris-nitrátu (pH 7,2) pomocí elektrod LACT10. Doba měření byla 75 s.

MĚŘENÍ KYSELINY MLÉČNÉ V KOMERČNÍCH PIVECH

Pro testování senzorů LACT10 na reálných vzorcích byly vybrány čtyři různé druhy piv z místního pivovaru Cotoya. Jednalo se o pivo typu India Pale Ale (IPA), u něhož je obsah kyseliny mléčné považován za normální, dále kyselé pivo vyrobené z acidulovaného sladu speciálně upraveného pro okyselení piva, ječné víno s vysokým obsahem alkoholu a lambické pivo (Al Debalu) získané procesem spontánní fermentace.

Aby se předešlo matricovým efektům, byly všechny vzorky před měřením naředěny v poměru 1:10 vodným roztokem 0,1 mol/l Tris-NO₃ při pH 7,2. Odplynění vzorků není nutné, neboť výsledky byly velmi podobné u odplyněného i neodplyněného piva.

K ověření získaných dat byla použita komerční souprava L-Lactate Assay. Optická měření byla provedena pomocí přístroje SPELEC a softwaru DropView SPELEC. U optické metody bylo nutné zvolit různé stupně ředění podle typu piva, aby se minimalizoval vliv matrice. Vzorek kyselého piva byl ředěn 1:100, IPA 1:20, lambické pivo Al Debalu 1:50 a ječné víno 1:10.

Výsledky získané oběma metodami – elektrochemickou a optickou – jsou znázorněny na Obrázku 3.

Obrázek 3. Porovnání dat získaných elektrochemickým senzorem laktátu od společnosti Metrohm DropSens (zelené) a optickou metodou pomocí sady L-Lactate Assay (šedé).

Vezměte na vědomí, že ječné víno nebylo možné správně změřit pomocí optické testovací soupravy kvůli jeho tmavě hnědé barvě, která rušila měření při vlnové délce 450 nm. V tomto případě dochází ke kompromisu mezi absorpcí světla pivem a nízkou koncentrací laktátu, kterou obsahuje. Výsledkem je nedostatečná citlivost metody pro daný vzorek. Tento problém lze vyřešit ošetřením piva pomocí PVPP (polyvinylpolypyrrolidonu), který odstraní zbarvení a tím eliminuje rušení měření způsobené absorpcí světla na příslušné vlnové délce.

Vzhledem k tomu, že výsledky získané oběma metodami jsou velmi podobné, tento protokol prokazuje možnost stanovení laktátu v pivu během méně než 75 sekund pomocí přenosného zařízení — bez nutnosti složitých předúprav nebo použití objemné optické techniky.

ZÁVĚR

Tato studie představuje elektrochemický biosenzor pro stanovení kyseliny mléčné v pivu. Vzorek je třeba pouze naředit v poměru 1:10 roztokem 0,1 mol/l Tris-NO₃ při pH 7,2. Pomocí jednoduché amperometrické metody lze během 75 sekund určit množství kyseliny mléčné ve vzorku piva bez jakékoli předúpravy. Naměřené hodnoty odpovídají výsledkům získaným tradiční metodou s komerční soupravou L-Lactate Assay a nepřenosným optickým zařízením.

KONFIGURACE

Samostatná elektrochemická čtečka přizpůsobená pro finální aplikace
DropStat Plus je přizpůsobitelná elektrochemická čtečka určená pro výzkumníky, kteří úspěšně vyvinuli elektrochemický senzor a chtějí získávat okamžité výsledky podle optimalizovaného postupu. Díky dotykovému displeji, lithium-iontové baterii a možnosti bezdrátového přenosu dat umožňuje uložit až 3 metody a až 8 kalibračních křivek pro každou metodu. Ideální k individualizaci jako OEM zařízení nebo produkt s privátní značkou.

Metrohm: Použití přenosného samostatného systému pro snadné monitorování fermentace: Samostatná elektrochemická čtečka přizpůsobená pro finální aplikace.

Kabelový konektor µStat pro sítotiskové elektrody
Umožňuje připojení jednotlivých SPE s jednou pracovní elektrodou (1 WE) k přístrojům µStat 200, µStat 300, µStat 400, µStat 4000/P, µStat 8000/P, µStatECL, SpectroECL a k celé řadě zařízení SPELEC.

Metrohm: Použití přenosného samostatného systému pro snadné monitorování fermentace: Kabelový konektor µStat pro sítotiskové elektrody.

Senzor laktátu
Vhodný pro stanovení L(+)-laktátu v kapalných vzorcích.

Metrohm: Použití přenosného samostatného systému pro snadné monitorování fermentace: Senzor laktátu.