Výskyt ochratoxinu A v pivech

Jednalo se o piva výčepní, ležáky, speciální, nealkoholická a pivní mixy. Celkem bylo analyzováno 132 vzorků. Ochratoxin A byl nalezen u 81 % z nich. Jeho koncentrace se pohybovala v rozmezí 1,0-194,6 ng.l⁻¹. Průměrný obsah ochratoxinu A ve všech vzorcích v souvislosti s rokem výskytu byl 14,2-39,9 ng.l⁻¹.

1 Úvod

Ochratoxin A (OTA) patří mezi významné nefrotoxické mykotoxiny s karcinogenními účinky a je spojován s nádory ledvin (Malíř et al., 2014). Tento toxický metabolit je v tropických a subtropických oblastech v potravinách produkován zejména vláknitými mikroskopickými houbami rodu Aspergillus. Optimální teplota pro jeho produkci (např. pro Aspergillus ochraceus) se pohybuje okolo 28 °C, i když může být touto vláknitou mikroskopickou houbou produkován v teplotním rozsahu 15–37 °C. V oblastech mírného podnebního pásu a v chladnějších oblastech je OTA produkován spíše vláknitými mikroskopickými houbami rodu Penicillium. Mikroskopické houby rodu Penicillium verrucosum jsou schopny produkovat OTA již v rozmezí od 4–30 °C (Malíř et al., 2003).

OTA se chová jako kumulativní jed s rychlou absorpcí a pomalým vylučováním. V organismu metabolizuje na hydroxylované deriváty, které se vyznačují obdobnými cytotoxickými a imunosupresivními účinky, jako OTA. Mezinárodní organizace pro výzkum rakoviny – IARC FAO/WHO (1993) klasifikuje OTA jako možný karcinogen pro člověka (kategorie 2B) (Anli et al., 2010).

OTA se vyskytuje v řadě komodit jak rostlinného, tak i živočišného původu (Malíř et al., 2003; Zöllner et al., 2006). Za jeho hlavní zdroje v potravinách jsou pokládány obiloviny (ječmen, žito, oves, pšenice, rýže, kukuřice) a výrobky z nich (Kabak, 2009), dále vinné hrozny a produkty z nich – víno, vinná šťáva a vinný ocet, a rovněž káva, luštěniny, koření a zelený čaj (Varga et al., 2005; Studer-Rohr et al., 1995).

V obilovinách je ochratoxin A produkován zejména mikroskopickou vláknitou houbou P. verrucosum, zřídka A. ochraceus. Kontaminace obilovin OTA je považována především za posklizňový problém (Amézqueta et al., 2009; Anli et al., 2010). Kritické faktory, které ovlivňují produkci OTA v napadených obilovinách během pěstování, sklizně a především skladování, jsou teplota, vlhkost a čas, po který je obilovina vystavena nepříznivým podmínkám (Amézqueta et al., 2009). OTA se přirozeně vyskytuje v ječmeni i ve sladu (Běláková et al., 2011). Ačkoli se OTA řadí mezi „skladištní“ mykotoxiny, může se vyskytovat i na poli nebo vznikat během procesu sladování (Anli et al., 2010).

Přítomnost OTA v pivu závisí na kontaminaci vstupních surovin, tj. sladovnického ječmene a sladu. Ochratoxin A je při vysokých teplotách relativně stabilní. Při rmutování část OTA přechází do mláta, část zůstává ve sladině. Při fermentaci se OTA může adsorbovat na kvasinky a zbytek přechází do piva (Scott, 1996; Baxter et al., 2001; Mateo et al., 2007). OTA je také hydrolyzován kyselinami a některými proteasami na ochratoxin α a fenylalanin (Inoue et al., 2013).

V naší práci jsme dlouhodobě monitorovali výskyt OTA v pivech.

2 Materiál a metody

V letech 2011–2014 byl sledován výskyt mykotoxinu OTA v lahvových pivech z maloobchodní sítě ČR. Jednalo se o piva výčepní, ležáky, speciály, nealkoholická a pivní mixy. Celkem bylo analyzováno 132 piv (viz tab. 1).

Tab . 1 Počty analyzovaných piv

Ochratoxin A (OTA) v pivu byl analyzován po předchozím přečištění přes imunoafinitní kolonku OCHRAPREP. Vzorek piva byl odplyněn na ultrazvuku a jeho pH bylo upraveno na 7,2 pomocí 2M roztoku hydroxidu sodného. Takto upravený vzorek byl aplikován přímo na imunoafinitní kolonku. K promytí kolonky byl použit fosfátový pufr PBS. Eluce byla prováděna opakovaně (třikrát) 1,5 ml směsí methanol/kyselina octová 98/2 (v/v). Eluát byl odpařen ve vakuové odparce. Před nástřikem byl odparek rozpuštěn v 1 ml směsi methanol/voda 50/50 (v/v). Pro analytické stanovení OTA v pivu byla použita metoda ultra vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s fluorescenční detekcí (UPLC / FLR). Separace byla provedena na chromatografické koloně Acquity UPLC BEH C18 (2,1 mm x 100 mm s velikostí částic 1,7 μm) pomocí gradientové eluce. Jako mobilní fáze byl použit acetonitril (ACN) a deionizovaná voda okyselená na pH 2,0 pomocí H3PO4. Separace byla provedena při 40 °C, průtoku mobilní fáze 0,3 ml.min⁻¹ a nástřiku 10 μl. Excitační a emisní vlnová délka byly 335 a 440 nm. Délka analýzy byla 5 minut. Byla optimalizována a validována metoda s gradientovou elucí (LOD 0,3 ng.l⁻¹, LOQ 1,0 ng.l⁻¹, RSD 4,8 %) (Běláková et al., 2011).

3 Výsledky a diskuse

Ochratoxin A v koncentraci vyšší než 1,0 ng.l⁻¹ byl nalezen u 81 % analyzovaných vzorků (tab. 2).

Tab . 2 Průměrný obsah OTA (ng .l⁻¹) v pivu

Průměrná koncentrace OTA v nealkoholických pivech byla 9,0 ng.l⁻¹, výčepních pivech 28,9 ng.l⁻¹, ležácích 29,2 ng.l⁻¹, speciálních pivech 16,9 ng.l⁻¹ a pivních mixech 27,9 ng.l⁻¹.

Podle nálezů OTA byla piva rozdělena do 4 kategorií (obr. 1).

Obr . 1 Rozdělení vzorků podle kategorií a zastoupení jednotlivých druhů piv

Koncentrace OTA < 1 ng.l⁻¹

25 piv (19 %) neobsahovalo OTA (OTA byl pod mezí stanovení). Tato kategorie zahrnovala všechny druhy sledovaných piv. Nejvíce byla zastoupena piva z roku 2014 (14 piv).

Koncentrace OTA < 10 ng.l⁻¹

38 piv (29 %) obsahovalo OTA v nízké koncentraci, která nepřevyšovala 10 ng.l⁻¹. V této kategorii byly také zastoupeny všechny druhy sledovaných piv, nejvíce z roku 2014 (17 piv).

Koncentrace OTA v rozmezí 10–100 ng.l⁻¹

62 piv (47 %) obsahovalo OTA v koncentraci, která nepřevyšovala 100 ng.l⁻¹. Byly zde zastoupeny všechny druhy sledovaných piv, nejvíce z roku 2011 (24 piv).

Koncentrace OTA > 100 ng.l⁻¹

7 piv (5 %) obsahovalo OTA v koncentraci vyšší než 100 ng.l⁻¹, nejvíce vzorků pocházelo z roku 2011 (4 piva). V této kategorii byly zastoupeny pouze ležáky a výčepní piva.

Maximální povolené limity OTA v potravinách v České republice a Evropské unii jsou stanoveny Nařízením komise (ES) č.1881/2006 stanovujícím maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách ve znění Nařízení komise (EU) č. 105/2010. Maximální limit pro výskyt OTA v ječmeni (nezpracovaná obilovina) je 5,0 μg.kg⁻¹ a sladu (produkt pocházející z nezpracované obiloviny) je 3,0 μg.kg⁻¹.

Maximální hodnota pro výskyt OTA v pivu nebyla dosud evropskou legislativou stanovena. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) stanovil v roce 2006 tolerovatelný týdenní příjem (TWI) pro OTA 120 ng.kg⁻¹ tělesné hmotnosti. TWI je dávka, kterou může spotřebitel přijmout během každého týdne svého života bez výrazného zvýšení poškození zdraví.

Nejvyšší koncentrace OTA v pivu, která byla během této studie na našem pracovišti naměřena, činila 194,6 ng.l⁻¹. Tato koncentrace byla naměřena v roce 2011, jednalo se o světlý ležák. Při vypití 0,5 l tohoto piva by byl konzument exponován dávkou 97,3 ng OTA. Průměrný muž, vážící 83 kg by takto přijal 1,0 % z TWI. Můžeme tedy říct, že obsah OTA v pivu nepředstavuje významné zdravotní ohrožení.

V roce 2005 bylo analyzováno 88 piv z obchodní sítě Španělska. OTA se vyskytoval v 83 % analyzovaných vzorcích v rozmezí 7,0–204 ng.l⁻¹ (Medina et al., 2005). V roce 2009 proběhla na VÚPS, a.s. v Brně studie, kde bylo analyzováno 115 piv z obchodní sítě ČR, OTA se vyskytoval ve 39 % vzorků, rozmezí kontaminace 1,0–244 ng.l⁻¹ (Běláková et al., 2011). V letech 2010–2011 bylo analyzováno 106 piv z obchodní sítě evropských zemí, OTA se vyskytoval v 68 % analyzovaných vzorků v rozmezí 5,0–189 ng.l⁻¹ (Bertuzzi et al., 2011).

Naše výsledky jsou plně v souladu s dříve publikovanými daty.

4 ZÁVĚR

Pivo patří mezi nejoblíbenější alkoholické nápoje po celém světě. V České republice činila jeho spotřeba v roce 2013 144 l na obyvatele (Český svaz pivovarů a sladoven). Z důvodu masivní spotřeby tohoto nápoje je nezbytné sledovat jeho kvalitativní parametry, ke kterým patří i možný výskyt ochratoxinu A. Přestože v naší studii bylo kontaminováno OTA 81 % vzorků, můžeme říct, že obsah OTA v pivu nepředstavuje pro konzumenta významné zdravotní ohrožení. Je však nezbytné výskyt OTA v pivu průběžně sledovat a chránit tak zdraví spotřebitelů.