Simultánní stanovení prenylflavonoidů a isoflavonoidů ve chmelu a pivu metodou HPLC-DAD: Studie aplikace homogenátu zeleného chmele v pivovarském procesu

Polyfenolové látky náležející do skupin prenylflavonoidů a isoflavonoidů mají účinky podporující zdraví a ochranu proti řadě civilizačních chorob. Působí jako antioxidanty, mají protirakovinné, antimikrobiální, protizánětlivé vlastnosti, některé jsou fytoestrogeny a působí proti osteoporóze.

Byla vypracována nová analytická metoda HPLC-DAD pro simultánní stanovení prenylflavonoidů (xanthohumol, isoxanthohumol, 8-prenylnaringenin, 6-prenylnaringenin) a isoflavonoidů (daidzein, genistein, formononetin a Biochanin A) ve chmelu a pivu a byla provedena studie dopadu chmelení homogenátem zeleného chmele stabilizovaného vysokým tlakem na obsah těchto látek v pivu. Vypracovaná metoda může najít uplatnění při monitorování obsahu bioaktivních flavonoidů ve chmelových surovinách a pivu. Aplikace homogenátu zeleného chmele (20 % alfa kyselin na várku) v poslední dávce chmelení přinesla zvýšení obsahu xanthohumolu a 6-prenylnaringeninu v pivu o přibližně 50 % resp. 100 % v porovnání se sušeným chmelem. Aplikace do vířivé kádě zvýšila obsah xanthohumolu a 8-prenylnaringeninu v pivu o přibližně 55 % resp. 115 %.

S výjimkou výrazného zvýšení hodnoty genisteinu aplikací do vířivé kádě nebyl zjištěn vliv nesušeného chmele na obsah isoflavonoidů v pivu. Chmelení homogenátem zeleného chmele ukazuje zajímavou možnost přirozeného zvýšení obsahu xanthohumolu v pivu. Výsledky úvodní studie budou ověřeny v dalším výzkumu.

1 ÚVOD

Flavonoidy náležející do skupin prenylflavonoidů a isoflavonoidů prokazují vlastnosti podporující zdraví a ochranu proti řadě civilizačních chorob (Kondo, 2003; Stevens, Page, 2004). Jediným zdrojem prenylflavonoidů v pivu je chmel. Isoflavonoidy v pivu pocházejí z chmele i sladu (Mikyška et al., 2007).

Ve chmelu je dominantním prenylflavonoidem xanthohumol (Krofta et al., 2005), který působí inhibičně na některé typy rakovinného bujení, má antimikrobiální, protizánětlivé a antioxidační účinky (Miranda et al., 2000; Gerhäuser, 2005). Xanthohumol společně s některými složkami chmelových pryskyřic působí inhibičně při vzniku osteoporózy (Tobe et al., 1997). Tepelnou izomerizací xanthohumolu vzniká v pivu výrazně převažující isoxanthohumol (Forster et al., 2002; Krofta, 2010), který je významným prekursorem 8-prenylnaringeninu vznikajícího působením bakterií ve střevním traktu (Possemiers et al., 2005). Spontánní transformací desmethylxanthohumolu z chmele vzniká 6-prenylnaringenin a 8-prenylnaringenin. Obě tyto látky, zejména 8-prenylnaringenin, jsou silnými fytoestrogeny (Milligan et al., 1999). Schéma transformací chmelových prenylflavonoidů je na obr. 1 (originální článek).

Isoflavonoidy daidzein, genistein a jejich prekursory formononetin a Biochanin A (obr. 2 – originální článek) jsou dlouho známými fytoestrogeny (Adlercreutz, 1990), inhibují růst a proliferaci některých typů nádorů, mají antioxidační a antimikrobiální účinky, působí proti osteoporóze (Adlercreutz et al., 1995; Foti et al., 2005; Medjakovic et al., 2008).

Pro stanovení xanthohumolu a pěti dalších flavonoidů v komplexní matrici piva a bylinných čajů s obsahem chmele vyvinuli (Stevens et al., 1999) metodu HPLC s MS-MS detekcí. Další vývoj techniky v oblasti HPLC-MS umožnil Česlové et al. (2009) stanovení xanthohumolu a prenylovaných flavonoidů současně s ostatními polyfenolickými sloučeninami a hořkými kyselinami v pivu a chmelových extraktech. Identifikace byla založena na kombinaci retenčních časů, UV a APCI-MS spekter. Obě detekční techniky UV- a APCI-MS byly použity pro kvantitativní stanovení a poskytly srovnatelné výsledky.

Magalhaes et al. (2007) sledovali obsah xanthohumolu a isoxanthohumolu ve chmelových produktech – peletách, ethanolickém a CO₂ extraktu metodou HPLC – DAD, kde pro potvrzení identifikace xanthohumolu a isoxanthohumolu použili HPLC-ESI-MS/MS. V další práci (Magalhaes et al., 2008) byly zmapovány jednotlivé fáze technologického procesu výroby piva a jejich vliv na izomerizaci xanthohumolu a studován dopad aplikace chmelových preparátů obohacených o xanthohumol. Obsah xanthohumolu a isoxanthohumolu v pivech a meziproduktech byl měřen metodou HPLC s UV detekcí. Byl potvrzen inhibiční vliv barevných sladů (karamelových a pražených) na isomerizaci xanthohumolu. Tento jev vysvětlil již dříve Walker et al. (2003) tvorbou komplexů xanthohumolu se složkami barevného sladu, chovajícími se odlišně od původního xanthohumolu. Koncentrace v tmavých pivech, naměřené pomocí LC-MS bez předchozího čištění SPE, proto mohou dosahovat až 10 mg/l a přesahují rozpustnost xanthohumolu (3,5 mg/l) v ethanolickém vodném roztoku. Wunderlich et al. (2009) vysvětlili nalezené vyšší koncentrace xanthohumolu v tmavých pivech bez předchozího SPE čištění ustanovováním rovnovážných koncentrací mezi volným a v komplexu vázaným xanthohumulonem. Krofta (2010) k monitoringu obsahu isoxanthohumolu a xanthohumolu v českých světlých pivech a zahraničních pivech, sledování ztrát při výrobě piva a sledování stability během skladování piva použil HPLC-DAD metodu s čištěním a zakoncentrováním vzorků pomocí SPE.

Pro stanovení isoflavonoidů daidzeinu, genisteinu, formononetinu a Biochaninu A v pivu byly vypracovány metody založené na imunochemické detekci (Lapčík et al., 1998), plynové chromatografii po izolaci a derivatizaci sledovaných látek na těkavé sloučeniny (Mikulíková et al., 2005) a HPLC-CoulArray (Kellner et al., 2007). Každá z těchto metod má specifické nevýhody.

Pro monitorování obsahu xanthohumolu a isoxanthohumolu v surovinách a jejich změn v průběhu výroby piva se jeví metoda HPLC-DAD jako postačující. Současné stanovení ostatních prenylflavonoidů a některých isoflavonoidů umožňuje získat komplexnější posouzení obsahu biologicky aktivních flavonoidů. Pro stanovení prenylflavonoidů i isoflavonoidů vyskytujících se v nižších nebo minoritních koncentracích je ovšem účinnější spojení HPLC s MS-MS detekcí, z důvodu vyšší citlivosti a selektivity.

V pivovarství je v posledním desetiletí věnována pozornost prenylflavonoidům. Jsou vypracovávány modifikované technologie pro výrobu piv s vyššími koncentracemi těchto biologicky aktivních látek aplikací chmelových preparátů obohacených xanthohumolem. Hlavními sledovanými složkami jsou xanthohumol a isoxanthohumol. Sušením chmele se část labilních sekundárních metabolitů chmele, ke kterým náleží i prenylflavonoidy a isoflavonoidy, ztrácí. Použití homogenitu zeleného chmele stabilizovaného vysokým tlakem může představovat netradiční postup pro zvýšení obsahu biologicky aktivních flavonoidů v pivu.

V tomto článku je popsána nově vypracovaná analytická metoda HPLC-DAD pro simultánní stanovení prenylflavonoidů a isoflavonoidů ve chmelu a pivu a výsledky úvodní studie dopadu chmelení homogenátem zeleného chmele na obsah těchto látek v pivu.

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Metoda simultánního stanovení prenylflavonoidů a isoflavonoidů

Chemikálie

Referenční standardy: xanthohumol, 6 – prenylnaringenin, 8 – prenylnaringenin byly zakoupeny od firmy Phytochem (Německo), isoxanthohumol od firmy AAPIN Chemicals Limited (UK), formononetin a Biochanin A od firmy Fluka, daidzein a genistein od firmy Sigma.

Kalibrační roztoky: navážením 0,2 – 1 mg každé sloučeniny s přesností 0,1 mg do 5 ml odměrky a doplněním po značku methanolem (čistoty pro gradient, Merck) byl připraven zásobní kalibrační roztok. Jeho ředěním methanolem stejné čistoty 10x, 50x, 100x, a 1000x do 10 ml odměrek byly připraveny kalibrační roztoky.

Pomocné roztoky: byly připraveny pomocí deionizované vody (Millipore, TOC < 5 ppb), methanolu p.a. (Merck), 85 % kyseliny fosforečné p.a. (Merck) a acetonu p.a. (Lachner).

Pro extrakci z piva:

1. deionizovaná voda okyselená kyselinou fosforečnou (100 : 0,2, v/v)
2. methanol + voda + kyselina fosforečná (20 : 80 : 0,2, v/v/v)
3. methanol okyselený kyselinou fosforečnou (100 : 0,2, v/v)

Pro extrakci chmelových preparátů:

4. 70% roztok acetonu ve vodě, extrakty byly filtrovány přes filtrační papír MUNKTELL kvality 1288

Analytický postup

Izolace flavonoidů z piva: vysoce hydrofobní isoflavonoidy a prenylflavonoidy byly extrahovány z piva na pevnou fázi (SPE, Strata C 18 – E, 500 mg/6ml, Phenomenex).

SPE kolonky byly ekvilibrovány 10 ml methanolu a následně 10 ml okyselené vody (roztok 1). 50 ml vzorku piva bylo odpěněno v ultrazvukové lázni a okyseleno 0,1 ml kyseliny fosforečné a aplikováno na kondicionovanou SPE kolonku. Proplachem kolonky 10 ml roztoku 2 byly odstraněny nečistoty a kolonka vysušena prosátím vzduchu asi po dobu 5 minut. Analyty byly potom vyeluovány roztokem 3 do objemu 2,5 ml.

Výtěžnost extrakčního postupu byla testována pomocí plzeňského piva. Na kolonkách byl extrahován jednak vzorek piva původního, jednak vzorek piva spikovaného. Podíl rozdílu koncentrací těchto vzorků a známého koncentračního navýšení o sledované analyty vyjádřený v procentech představuje výtěžnost extrakčního postupu na modelovém vzorku plzeňského piva. Získané výsledky pro jednotlivé analyty podává tab. 1.

Tab . 1 Výtěžnost extrakčního postupu pro vzorek plzeňského piva

Extrakce flavonoidů z chmelových preparátů: 0,8 g sušeného chmele nebo 8 g homogenátu bylo extrahováno na horizontální-podélné třepačce, 140 min–1 (Bühler KS15A/B, Německo) ve 250 ml roztoku 4 po dobu 40 minut a extrakt přefiltrován. 10 ml extraktu sušeného chmele resp. 5 ml extraktu chmelového homogenátu bylo odpařeno do sucha na rotační vakuové odparce při 60 °C do sucha. Odparek byl rozpuštěn v 5 ml methanolu čistoty pro gradient (Merck).

Chromatografické podmínky:

Analyty byly separovány na reverzní fázi Purospher STAR, RP-18e se zrněním částic 5μm, rozměry kolony byly 250 x 4 mm (Merck).

K separaci byly použity mobilní fáze: A ultračistá voda (TOC < 5 ppb) okyselená kyselinou mravenčí pro MS na pH v rozmezí 3–4, B acetonitril pro gradient. Pro separaci byl použit gradient: 0–10 min. 40–52,5 % B, 10–20 min. 52,5–57,5 % B, 20–21 min. 57,5–40 % B, 21–26 min. 40% B.

Chromatografická aparatura se skládala z kvarterní pumpy P4000, dávkovače AS3000 a DAD detektoru UV6000LP, vše od Thermo Separation Products (TSP, USA). Chromatografická data byla snímána a zpracována chromatografickým softwarem ChromQuest 2.1 (TSP, USA).

Pro hodnocení čistoty píků bylo použito skenování od 250 do 400 nm a softwarová funkce pro výpočet indexů vypovídajících o homogenitě eluční zóny. V retenčních časech sledovaných flavonoidů byla prokázána vysoká čistota elučních zón a tím i dostatečná selektivita chromatografického systému pro jejich měření a vyhodnocení.

Na kolonu bylo dávkováno 10 μl vzorku, kolona byla udržována na teplotě 35 °C, průtok mobilní fáze byl 0,8 ml/min. Xanthohumol byl detekován a vyhodnocen při vlnové délce 370 nm, ostatní flavonoidy při 290 nm.

2.2 Pivovarské pokusy

Chmel

Homogenát nesušeného chmele byl připraven patentovaným postupem (Houška et al., 2009). Zelené chmelové hlávky odrůd Žatecký poloraný červeňák a Agnus byly odebrány na začátku sušicí linky na zpracování chmele a homogenizovány v mixeru v inertní atmosféře bez přístupu vzduchu. Homogenát byl plněn do bariérových obalů a sterilizován vysokým tlakem. Současně byly na výstupu sušicí linky odebrány vzorky sušeného chmele. Vzorky byly uchovávány v evakuovaných obalech a před aplikací jemně rozemlety. V homogenátech a sušených chmelech byl stanoven obsah vody, α-kyselin, β-kyselin (Analytica EBC, 1998) a obsah prenylflavonoidů a isoflavonoidů.

Várky

Byly připraveny dvě série várek 11% světlého piva. Pro hlavní chmelení byl použit chmelový extrakt superkritickým oxidem uhličitým, který má velmi nízký obsah prenylflavonoidů (Magalhaes et al., 2007). Celková dávka chmelových preparátů byla vypočítána na výslednou hořkost 25 B.U.

V první sérii pokusů bylo testováno použití chmelového homogenitu jako poslední dávky chmelení. Mladina chmelená CO₂ extraktem (80 % celkové dávky α kyselin) byla připravena ve 200 l pokusném pivovaru a byla rozdělena na podíly o objemu 40 l pro následný 15minutový chmelovar v menším pokusném pivovaru. Byly použity chmelové homogenáty (ŽPČ HT, Agnus HT) a referenční sušené chmele (ŽPČ SO, Agnus SO).

Druhá série pokusů byla zaměřena na „nízkoteplotní“ extrakci chmelových flavonoidů. Mladina chmelená CO2 extraktem na 100 % celkové dávky alfa-kyselin byla opět připravena v objemu 200 l. Chmele ŽPČ HT a ŽPČ SO byly v dávce shodné s prvou sérií pokusů (20 % – α kyselin na várku) a byly aplikovány do sedimentační nádoby (doba kontaktu 1,5 hodiny) nebo při sudování (doba kontaktu 30 dnů při teplotě 0–2 °C). Piva byla filtrována celulózovými deskami a stočena do lahví pod oxidem uhličitým.

Chemický rozbor piv byl proveden metodami dle Analytiky EBC (Analytica EBC, 1998). Piva byla senzoricky hodnocena deskriptivní metodou VÚPS (Čejka et al., 2002)

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1 Metoda stanovení prenylflavonoidů a isoflavonoidů

Linearita odezvy detektoru

V rozsahu koncentrací 0,04 – 8,2 mg/l, v němž byly měřeny daidzein, genistein, formononetin, isoxanthohumol, 8 – prenylnaringenin a 6 – prenylnaringenin (obr. 3a), a v rozsahu koncentrací 0,15–23,4 mg/l, v němž byly měřeny Biochanin A a xanthohumol (obr. 3b), vykazoval detektor lineární závislost odezvy na koncentraci. Odezva byla vyjádřena plochou píku.

Obr . 3a Lineární odezva UV detektoru

Obr . 3b Lineární odezva UV detektoru

Meze stanovení a meze detekce

Meze stanovení a meze detekce byly určeny pro každý analyt z příslušné kalibrační závislosti. Poměr signál/šum odpovídal hodnotě 3 pro mez detekce a hodnotě 10 pro mez stanovení. Směrnice jednotlivých kalibračních přímek procházejících počátkem a vypočítané meze stanovení pro pivo v návaznosti na extrakční postup podává tab. 2. V této tabulce jsou dále uvedeny meze stanovení odpovídající metodickému postupu pro extrakce z matrice chmelového homogenátu a matrice suchého chmele.

Tab . 2 Meze stanovení analyzovaných flavonoidů v matrici piva a chmele

Vypracovaná HPLC metoda s UV detekcí a ověřenou čistotou píků odpovídající sledovaným analytům poskytuje velmi dobrý nástroj k posouzení obsahu prenylflavonoidů a isoflavonoidů v matrici použitých sušených chmelů a chmelových preparátů. Stejná metoda vykazuje v případě analýzy piva uspokojivé výsledky pro kvantifikaci daidzeinu, xanthohumolu, isoxanthohumolu, 8-prenylnaringeninu a 6- prenylnaringeninu. Hodnoty koncentrací pro genistein, formononetin a Biochanin A se však u analyzovaných piv nacházejí pod mezí stanovení použité metody. V matrici sledovaných chmelů byly zjištěné výsledky pod mezí stanovení ojediněle (tab. 3).

Tab . 3 Obsah hořkých látek (%) a flavonoidů ve chmelech (mg/kg sušiny

Vzorový chromatogram pořízený pro matrici chmele podává obr. 4, chromatogram pro matrici piva je na obr. 5.

Obr . 4 Chromatogram flavonoidů a prenylflavonoidů ve vzorku homogenátu nesušeného chmele Žatecký červeňák, UV detekce UV při 290 nm

Obr . 5 Chromatogram flavonoidů a prenylflavonoidů ve vzorku piva, UV detekce při 290 nm

V případě chmelové matrice, kde je extrakční prostředí tvořeno 70 % acetonu, který vykazuje střední polaritu, nelze zařadit další čisticí kroky na reverzní fázi a vzorek je proto odpařen a rozpuštěn v methanolu pro další HPLC stanovení. Docílení snížení mezí stanovení je možné řešit zvýšením navážky analyzovaného vzorku při zachování ostatních analytických podmínek.

V případě matrice piva, kde jsou látky extrahovány z vodně alkoholického prostředí (4 % alkoholu) na pevné fázi C18, by bylo možné aplikovat větší množství vzorku za předpokladu, že nebude překročena kapacita sorbentu a případným následným zahuštěním eluátu.

V obou případech aplikace většího objemu nebo navážky vzorku je však nutné uvažovat i zvýšení koncentrací ostatních neanalyzovaných látek v obou matricích. Je tedy nutné, aby pro separaci byla zajištěná dostatečná účinnost kolony a nedocházelo k nežádoucím koelucím s doprovodnými složkami matrice. Splnění této podmínky je třeba ověřit zjištěním čistoty elučních zón.

3.2 Pivovarské pokusy

Chmel

Sušením se ztrácí část chmelových pryskyřic a silic. Homogenáty zeleného chmele ŽPČ a Agnus obsahovaly v porovnání se sušenými chmely o 38 %, respektive 26 % vyšší množství β-kyselin v porovnání se sušeným chmelem. Je známo, že β-kyseliny jsou citlivější na oxidaci nežli α-kyseliny (Verzele a De Keukeleire, 1991). Obsah α-kyselin v homogenátu byl vyšší (o 14 %) pouze u chmele Agnus. U tohoto homogenátu byl v porovnání se sušeným chmelem o 22 % vyšší obsah xanthohumolu (tab. 3). Obsah isoxanthohumolu a 6-prenylnaringeninu byl nižší v termicky neupravených chmelových homogenátech. Opačný trend byl zjištěn pro 8-prenylnaringenin. Obsah isoflavonoidů neukázal jednoznačný trend ve vztahu k posklizňovému zpracování chmele.

Pivo

Varní pokusy byly zaměřeny především na výzkum dopadu aplikace nesušeného chmele na obsah biologicky aktivních iso- a prenylflavonoidů v pivu. V první sérii, kdy byly chmele vařeny 15 minut v mladině chmelené CO₂ extraktem na 80 % cílové hořkosti piv 25 j.h., je patrná vyšší míra využití α-kyselin u homogenátů. Analytická hořkost i obsah iso-α-kyselin v pivech chmelených homogenity zeleného chmele byly překvapivě výrazně vyšší v porovnání se sušeným chmelem (tab. 4). Zda se jedná o obecnou vlastnost chmelení zeleným chmelem, bude nutno ověřit v dalších pokusech. Hypotetickým vysvětlením je rychlejší rozpouštění α-kyselin a nižší ztráty iso- α-kyselin sorpcí na kaly při aplikaci zeleného chmele.

Tab . 4 Výsledky rozboru piv

Barva a pH piv chmelených homogenátem zeleného chmele byly mírně vyšší v porovnání se srovnávacím pokusem. Chmelovar se zeleným chmelem i jeho aplikace ve vířivé kádi ve druhé sérii várek měla za následek nižší prokvašení piv. Může se jednat o inhibiční působení zvýšeného množství beta-kyselin v mladině nebo působení látek, které se transformují při sušení chmele. Pro prvou variantu hovoří skutečnost, že při dlouhodobé maceraci chmele aplikovaného při sudování bylo stanoveno nižší prokvašení u piv se sušeným i nesušeným chmelem.

Obsah studovaných isoflavonoidů v pivech byl s výjimkou daidzeinu blízký mezi kvantifikace nebo nižší. Vliv formy chmele nebo způsobu chmelení na obsah isoflavonoidů v pivu není zjevný.

Obsah xanthohumolu v pivech byl v rozmezí 28–61 μg/l a byl blízký průměrnému obsahu ve 30 českých ležáckých pivech z osmi pivovarů (33,4) stanovenému Kroftou (2005). Obsah xanthohumolu v pivu stoupal při pozdější aplikaci chmele. Malý rozdíl byl mezi chmelením do vířivé kádě a chmelením na začátku dokvašování (tab. 5). Obsah isoxanthohumolu naopak výrazně klesal od chmelovaru po chmelení při sudování piva. Kromě chmelení při sudování přinesla aplikace homogenátu zeleného chmele zvýšení obsahu xanthohumolu v pivu o přibližně 50 % v porovnání se sušeným chmelem (tab. 6). Vyšší hodnoty isoxanthohumolu u piv s chmelovým homogenátem (o 30 a 16 %) byly stanoveny pouze pro chmelovar.

Tab . 5 Obsah isoflavonoidů a prenylaflavonoidů v pivech (μg/)

Obsah 8-prenylnaringeninu v pivu (3,7–12,5 μg/l) byl při aplikaci chmelového homogenátu za varu jen mírně vyšší oproti sušenému chmelu. Pro 6-penylnaringenin byly přes jeho nižší obsah stanovený ve chmelovém homogenátu zjištěny výrazně vyšší hodnoty v pivu po aplikaci při chmelovaru, o 118 a 77 % v porovnání se sušeným chmelem (tab. 6). Rovněž při chmelení do vířivé kádě byly pro chmelový homogenát naměřeny vyšší koncentrace 8-PN a 6-PN v pivu.

Tab . 6 Rozdíl obsahu prenylaflavonoidů v pivech chmelených sušeným a zeleným chmelem (% rel .)

Chmelení homogenátem zeleného chmele ve výši 20 % z celkové dávky chmele nemělo výrazný negativní či pozitivní vliv na organoleptické vlastnosti piva. Senzorický profil pokusných piv byl při aplikaci chmelového homogenátu do vířivé kádě a při sudování shodný se srovnávacími várkami. Piva chmelená homogenátem za varu byla hodnocena mírně lépe nežli piva chmelená sušeným chmelem. Důvodem mohla ovšem být i nižší hořkost srovnávacích piv (tab. 7).

Tab . 7 Výsledky senzorické analýzy piv

4 ZÁVĚR A VÝHLED

Vypracovaná nová analytická metoda HPLC-DAD pro simultánní stanovení prenylflavonoidů (xanthohumol, isoxanthohumol, 8-prenylnaringenin, 6-prenylnaringenin) a isoflavonoidů (daidzein, genistein, formononetin a Biochanin A) ve chmelu a pivu bude využita při dalším výzkumu a může najít uplatnění při monitorování obsahu bioaktivních flavonoidů ve chmelových surovinách a pivu. Parametry metody umožňují uspokojivě zhodnotit složení isoflavonoidů a prenylflavonoidů v chmelové matrici. V případě piva se koncentrace prenylflavonoidů nacházejí nad mezí stanovení, zatímco koncentrace isoflavonoidů většinou leží pod mezí stanovení. Zvýšení množství zpracovávaného vzorku při zachování ostatních parametrů metody teoreticky může vést ke snížení mezí stanovení jednotlivých analytů ve studovaných matricích. Vypracovaná metoda je však limitována účinností kolony určující dostatečné oddělení jednotlivých elučních zón nutné k zachování čistoty (homogenity) analyzovaných složek. Nesmí tedy docházet ke koelucím s ostatními složkami matrice.

Provedená úvodní studie dopadu chmelení homogenátem zeleného chmele stabilizovaného vysokým tlakem na obsah bioaktivních flavonoidů v pivu ukázala některé výhody homogenátu zeleného chmele oproti chmelu sušenému. Aplikace homogenátu zeleného chmele (20 % alfa kyselin na várku) v poslední dávce chmelení přinesla zvýšení obsahu xanthohumolu a 6-prenylnaringeninu v pivu o přibližně 50 % resp. 100 % v porovnání se sušeným chmelem. Aplikace do vířivé kádě zvýšila obsah xanthohumolu a 8-prenylnaringeninu v pivu o přibližně 55 % resp. 115 %. S výjimkou výrazného zvýšení hodnoty genisteinu aplikací do vířivé kádě nebyl zjištěn vliv nesušeného chmele na obsah isoflavonoidů v pivu. Chmelení homogenátem zeleného chmele ukazuje zajímavou možnost přirozeného zvýšení obsahu xanthohumolu v pivu. Výsledky úvodní studie budou ověřeny v dalších pokusech.