Průvodce řešením problémů v HPLC - Retenční čas, Rozlišení, Citlivost, Drift a Šum

V prvním díle seriálu o řešení problémů v HPLC jsme se podívali na základní tipy jak Váš HPLC systém provozovat a také osvědčené postupy pro odstraňování problémů, pokud se nakonec vyskytnou.

Druhý díl - chromatografické píky přinesl detailnější pohled na problematiku chromatografických píků z pohledu chvostování nebo frontování, širokých píků, žádných píků, píků navíc nebo píků dvojitých.

Třetí díl seriálu rozebere postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC

Kompletní příručka dostupná ke stažení v knihovně!

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Fluktuace retenčních časů

Fluktuace retenčních časů

Průtok

• Zkontrolujte, zda metoda používá správný průtok. Průtokoměrem zjistěte skutečný průtok.

Nedostatečná stabilizace

• Kolona s reverzní fází by měla být ekvilibrována nejméně deseti-násobným objemem MF. Pokud je i toto nedostatečné, zvyšte čas ekvilibrace.
• Platí i pro další techniky, jako je iontová výměna a HILIC.

Špatná regulace teploty

• Zkontrolujte, zda metoda používá správnou teplotu.
• Zajistěte, aby teplota v kolonové peci byla přesná.

Změna rozměrů kolony

• Ujistěte se, že je použita správná kolona včetně rozměrů.

Změna stacionární fáze kolony

• Pro paměťové efekty nepoužívejte kolonu s ion párovým činidlem pro jinou mobilní fázi.
• Vysušená stacionární fáze (historicky nesprávně „kolaps fáze“)

Nesprávná mobilní fáze

• Zajistěte, aby byla mobilní fáze připravena správně.
• Pokud používáte čerpadlo k směšování mobilní fáze, ověřte, že dávkování je přesné.
• Zajistěte, aby byla použita správná mobilní fáze a správné trasy dle zvolené metody.

Netěsnosti

• Zkontrolujte, zda v systému nejsou uvolněné spoje.

Vzduchová bublina v čerpadle

• Odvzdušněte čerpadlo pomocí odvzdušňovacího ventilu.

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Ztráta rozlišení

Ztráta rozlišení

Změna šířky píků

• Změny vlastností kolony a nástřiku vzorku/účinnosti kolony může mít za následek rozšíření píků.
• Zajistěte, aby kolona nebyla přetížena nebo vyměňte kolonu aby zatížení snesla.

Změny retenčního času

• Viz popis v části retenční čas.

Změna mobilní fáze nebo odpaření

• Připravte nové mobilní fáze.

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Změny citlivosti

Změny citlivosti

Problém s injektorem

• Změny dávkovacího objemu injektoru, k identifikaci změn použijte QC kontrolní vzorek.
• Zkontrolujte metodu a podrobnosti k nástřiku.
• Zvyšte proplach jehly a smyčky k potlačení přenosu vzorku mezi nástřiky.
• Odvzdušněte dávkovací čerpadlo.

Vzorek

• Degradace vzorku může snížit píky analytů a zvýšit píky nečistot. Připravte nový vzorek.
• Zkontrolujte přípravu vzorku aby bylo zajištěno, že koncentrace se nezměnila.

Detektor

• Pokud se změnila citlivost u všech píků, zkontrolujte nastavení a citlivost detektoru.
• Zkontrolujte životnost lampy a vyměňte ji, pokud je za limitem.
• Možná bude nutné vyměnit okénka průtokových kyvet.

Změna vlastností kolony

• Zkontrolujte šířky píku a rozlišení. Otestujte výkon kolony pomocí standardního QC testu.

Netěsnosti přístroje

• Zkontrolujte, zda v systému nejsou uvolněné spoje.

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Drift základní linie

Drift základní linie

Fluktuace teploty kolony

• Zkontrolujte teplotu kolony.

Nízká kvalita mobilní fáze

• Použijte HPLC rozpouštědla, vysoce čisté soli a přísady.
• Zajistěte, aby byly mobilní fáze dostatečně odplyněny.

Kontaminant nebo vzduchová bublina v kyvetě detektoru

• Propláchněte průtokovou kyvetu isopropanolem.
• Je-li nutno, propláchněte kyvetu 1M kys. dusičnou.

Prasklé okénko kyvety

• Vyměňte okénka kyvety.

Problém s mícháním mobilní fáze

• Použijte větší nebo efektivnější mixér.

Pomalá ekvilibrace kolony

• Vypláchněte kolonu mobilní fází (minimálně 10–20 objemy kolony).

Analyty s dlouhým RT eluující v dalším nástřiku

• Použijte proplach mezi nástřiky, nebo, pokud je možno, použijte zpětný proplach kolony k vymytí kontaminantů s dlouhým retenčním časem.

Recyklovaná mobilní fáze, ale detektor není správně vynulován

• Proveďte autozero detektoru.

Detektor (UV) není nastaven na maximum absorbance

• Změňte vlnovou délku na maximum UV absorbance.

Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Šum základní linie

Šum základní linie

Bublina v detektoru nebo čerpadle

• Dostatečně odplyňte mobilní fázi a propláchněte cestu MF (mobilní fáze)

Netěsnost

• Zkontrolujte cesty MF a spojky

Nedokonalé míchání mobilní fáze

• Předmíchejte mobilní fázi nebo použijte větší mixér

Teplotní změny detektoru

• Použijte teplotně stabilizovanou průtokovou celu detektoru

Kontaminovaná nebo vadná mobilní fáze

• Zkontrolujte mobilní fázi

Nemísitelné složky mobilní fáze (pozorujeme i tlakové pulzy)

• Použijte mísitelné složky MF

Bublina zachycená v systému

• Propláchněte a vyčistěte průtokovou cestu

Slabá lampa detektoru

• Vyměňte lampu

Únik náplně kolony

• Vyměňte kolonu