Jak důležité jsou pomocné kapaliny? (Petr Butzke, Waters VIZE 2022)

💡 Pozvánka: Waters seminář - Setkání uživatelů 2023

• Termín: 21. - 22. 11. 2023
• Místo: Hotel Horal Špindlerův Mlýn

Pomocné roztoky v kapalinové chromatografii

• Pomocné solventy jsou nezbytné pro správnou činnost kapalinového chromatografu

• Složení pomocného roztoku záleží na jeho funkci v systému

  • Požadavek - rozpouštění anorganického pufru – solvent s vysokým obsahem vody
  • Požadavek - rozpouštění organických látek (analyt, nečistoty vzorku) – solvent v vysokým podílem organického rozpouštědla.

• Složení pomocného roztoku

  • kompatibilita s mobilní fází (např. systém v RP x systém v NP)
  • kompatibilita koncentrační (objemová kontrakce pracuje i v kapilárních rozměrech, příklad čistý methanol a voda)

👉 Registrace a další informace: Waters CZ Webinář: Urychlete vývoj HPLC metody o 30 %

Waters Corporation: Urychlete vývoj HPLC metody o 30 %

Oplach pístů (Seal Wash)

Oplachová kapalina zajišťuje očišťování povrchu pístu od případných anorganických nečistot, které se na safírovém povrchu pístu deponují při použití mobilních fází s obsahem pufrů. Oplach pístů prodlužuje životnost těsnění v čerpadle.

• Doporučení pro systémy v reverzní fázi: 10 – 20% MeOH (ACN)/voda

  • Při rutinním provozu 1 x týdně obsah zásobní lahve vyměnit

• Doporučení pro systémy v normální fázi: rozpouštědlo kompatibilní s aktuální mobilní fází bez obsahu vody, zpravidla methanol, ethanol.

Waters Corporation: Použití nevhodného solventu (s nízkým obsahem vody)

Nástřik vzorku – principy, pomocné solventy

Princip nástřiku s děleným tokem mobilní fáze

• W2695 (Alliance)
  • solvent: „Needle wash”

Princip nástřiku v systému s průtočnou jehlou (flow throw needle, FTN)

• Acquity H class, Acquity ARC, ARC HPLC, Acquity I class (FTN)
  • solvent : „Purge solvent” + „Wash solvent“

Principy nástřiků v systému s pevnou smyčkou (fixed loop, FL)

• Acquity UPLC, Acquity I class (FL)
  • solvent : „Weak wash” + „Strong wash“

Separační modul W2695

• kontrola oplachu pístů (DIAGNOSTICS - Prime Seal Wash)

• provést oplach jehly (DIAGNOSTICS - Needle Wash)

• fluidické cesty / dry prime, wet prime

• proplach injektorové části systému (PURGE)

• ekvilibrace / kondicionace systému

  • (Kondicionace systému – v případě aplikace s gradientem mobilní fáze)

! Kontrola zásobních solventů a oplachových kapalin !

Waters Corporation: Proplach čerpadla Separační modul W2695

• Rozsah průtoku: 0 – 10 mL/min
• Tlakový limit systému: 6000 psi.
• Velikost částic kolony: 3,5 mm a větší

Proplach čerpadla

• pro dokonalé propláchnutí každé fluidické cesty (A, B, C, D) proplach cca 30 – 40 mL mobilní fáze

• Wet Prime: průtok 7,5 mL/min po dobu 5 minut (pro každou fluidickou cestu)

Doporučené pomocné solventy

Oplach jehly (Needle Wash)

Oplachová kapalina zajišťuje očišťování vnějšího povrchu jehly od depozitů vzorku.

Doporučení pro systémy v reverzní fázi: 50 – 100% MeOH (ACN) / voda

Doporučení pro systémy v normální fázi: rozpouštědlo kompatibilní s aktuálním vzorkem

Nevhodný výběr oplachové kapaliny pro danou aplikaci může způsobit přenos vzorku (carry over).

Waters Corporation: Separační modul W2695 využívá děleného toku mobilní fáze

Acquity H class, Acquity ARC, ARC HPLC

• kontrola oplachu pístů - Prime Seal Wash

• provést prime injektoru (Purge solvent, Wash solvent)

• fluidické cesty – proplach mobilními fázemi

• ekvilibrace / kondicionace systému

  • (Kondicionace systému – v případě aplikace s gradientem mobilní fáze)

! Kontrola zásobních solventů a oplachových kapalin !

Acquity H-class

• Rozsah průtoku: 0 – 2 mL/min
• Tlakový limit systému: 15 000 psi
• Velikost částic kolony: 1,7 mm (UPLC kolony) a větší

Waters Corporation: Příprava čerpadla – fluidická cesta pro oplach pístů Acquity H-class

Příprava čerpadla

• pro dokonalé propláchnutí každé fluidické cesty (A, B, C, D) proplach cca 30 – 40 mL mobilní fáze

• Prime při daném průtoku 4 mL/min po dobu 7 - 8 minut (pro každou fluidickou cestu)

• Kontrola fluidické cesty pro oplach pístů

Waters Corporation: Pozice jehly a nástřikového ventilu během analýzy (Acquity H-class)

Waters Corporation: Nasávání vzorku (Acquity H-class)

Nástřikový systém „Flow Throw Needle“ (FTN)

Purge solvent

• Solvent ve fluidickém systému injektoru, slouží jako „kapalinový píst“ ve stříkačce, doporučený solvent: ACN/voda v poměru 10/90 až 50/50
  • Spotřeba purge solventu je minimální.

Pro rutinní propláchnutí provést 10 proplachových cyklů.

Pro dokonalé propláchnutí této fluidické cesty je nutno provést 40 cyklů.

Waters Corporation: Nástřikový systém „Flow Throw Needle“

Wash solvent

• Wash Solvent - oplach vnějšího povrchu jehly, lze nastavit před, po nástřiku, zpravidla defaultní nastavení postačuje - doporučený solvent: 50 až 100 % ACN/voda

Pro rutinní propláchnutí proplachovat 10 sec.

Pro dokonalé propláchnutí této fluidické cesty proplachovat 180 sec.

Acquity ARC & ARC HPLC

• Rozsah průtoku: 0 – 5 mL/min
• Tlakový limit systému: 9500 psi.
• Velikost částic kolony:
  • Acquity ARC – vnitřní průměr kapilár: 0.007 “ – optimalizován pro kolony s velikostí částic 2,5 – 5 mm.
  • ARC HPLC – vnitřní průměr kapilár: 0.010 “ – optimalizován pro kolony s velikostí částic 3 – 5 mm.

Proplach čerpadla

• pro dokonalé propláchnutí každé fluidické cesty (A, B, C, D) proplach cca 30 – 40 mL mobilní fáze

• Prime při daném průtoku 10 mL/min po dobu 4 minut (pro každou fluidickou cestu)

Acquity UPLC

!!!!! Než začneme měřit !!!!!

• kontrola oplachu pístů - Prime Seal Wash

• provést prime injektoru (Weak wash solvent, Strong wash solvent)

• fluidické cesty – proplach mobilními fázemi

• ekvilibrace / kondicionace systému

  • (Kondicionace systému – v případě aplikace s gradientem mobilní fáze)

! Kontrola zásobních solventů a oplachových kapalin !

• Rozsah průtoku: 0 – 2 mL/min
• Tlakový limit systému: 15 000 psi
• Velikost částic kolony: 1,7 mm (UPLC kolony) a větší

Proplach čerpadla

• Acquity UPLC – binární čerpadlo

• Pro dokonalé propláchnutí každého čerpadla (A, B) proplach cca 30 – 40 mL mobilní fáze

• Prime při daném průtoku 4 mL/min po dobu 7 - 8 minut (prime obou čerpadel současně)

Nástřik typu „Fix Loop“ v modu PLUNO (partial needle loop overfill)

Princip: stříkačka nasaje do fluidiky větší zónu vzorku. Ventil se přepne do plnící polohy a stříkačka zpětným pohybem nadávkuje zadaný nástřikový objem do smyčky. Ventil se přepne do pozice „nástřik“ a odřízne nepotřebný zbytek vzorku, který je vypláchnut do odpadu. Obsah smyčky je dopraven na kolonu.

Waters Corporation: Nástřik typu „Fix Loop“ v modu PLUNO (partial needle loop overfill)

Nástřikový systém „Fix loop“

Weak Solvent - dopravní kapalina při nasávání vzorku - doporučený solvent s nízkou eluční silou, doporučení - stejný nebo menší obsah organické složky než je složení mobilní fáze v okamžiku nástřiku. Defaultní objem solventu k proplachu je 600 mL.

Doporučený solvent: 10 až 30 % ACN/voda

Pro rutinní propláchnutí proplachovat 7 cyklů (7x 2.5 mL).

Strong Solvent - oplach vnějšího a vnitřního povrchu jehly po nástřiku. Defaultní objem solventu k proplachu je 600 mL.

Doporučený solvent: 50 až 100 % ACN

Pro rutinní propláchnutí proplachovat 7 cyklů (7x 2.5 mL)

Při proplachu Weak a Strong solventu při zadání 7 cyklů, proběhne cyklů 14, střídavě 7 cyklů Weak a 7 cyklů Strong solventu, písty stříkaček jsou poháněny jedním motorem.

!!! Strong solvent musí mít svůj vlastní rezervoár na solvent, při prvním cyklu proplachu se obsah stříkačky pro Strong solvent vrací do zásobní láhve!!!

Nástřikový systém FTN vs. Fix Loop

FTN pomocné solventy: (ACQUITY H class, ACQUITY ARC, ARC HPLC)

• PURGE Solvent
• WASH Solvent

FL (fix loop) pomocné solventy: (ACQUITY UPLC, popřípadě samplery s označením FL)

• WEAK WASH Solvent
• STRONG WASH Solvent

Samá voda…

Proč nenechávat čistou vodu v chromatografickém systému?

Bakteriální růst způsobí ucpávání všech pórézních dílů ve fluidické cestě:

• solvent filtry v zásobních lahvích
• kontaminace zpětných ventilků
• in line filtry a vnitřní povrchy fluidických cest
• vstupní filtr na hlavě kolony (kolona začne tlakovat)

Waters Corporation: Včerejší vodu už nelze nazvat čerstvou…