Vliv systémového objemu na gradientovou separaci (VIZE 2021)

Proč se liší separace směsi látek za identických podmínek na různých chromatografických systémech?

Chromatografické systémy mají rozdílnou specifikaci: Gradient delay volume (systémový objem)

Pojmy „dwell volume“, „void volume“ a ekvivalenty v češtině

Dwell volume (systémový objem)

Vnitřní objem fluidických cest chromatografického systému od místa, kde dochází k smísení složek mobilní fáze při tvorbě gradientu mobilní fáze až k místu injektáže vzorku.

Void volume (dead volume, mrtvý objem)

Objem mobilní fáze pro nezadržovanou složku v chromatografickém systému. Složka se pohybuje rychlostí mobilní fáze. Jsou to fluidické cesty (a volný objem v koloně) mezi injektorem a detektorem.

• Waters ACQUITY PREMIER System
• Waters ACQUITY Arc System
• Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS System
• Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS System
• Waters Arc Premier System
• Waters ACQUITY UPC2 System
• Waters ACQUITY Advanced Polymer Chromatography (APC) System

Vysokotlaký gradient

Tvorba vysokotlakého gradientu s použitím dvou čerpadel.

Waters Corporation: Vysokotlaký HPLC gradient

• (1) zásobníky mobilní fáze
• (2A,B) selekční ventily
• (3) hlavy čerpadla
• (4) písty čerpadla s pružinou
• (5) pohonná jednotka čerpadla s motorem
• (6) směšovač
• (7) směr toku mobilní fáze k vysokotlaké části systému

Nízkotlaký gradient

Tvorba nízkotlakého gradientu pomocí rychlého proporcionálního ventilu.

Waters Corporation: Nízkotlaký HPLC gradient

• (1) zásobníky mobilní fáze
• (2) gradientový proporcionální ventil
• (3) hlavy čerpadla
• (4) písty čerpadla s pružinou
• (5) pohonná jednotka čerpadla s motorem
• (6) směšovač
• (7) směr toku mobilní fáze

Systémový objem

Porovnání vysokotlaký vs. nízkotlaký gradient.

Waters Corporation: Porovnání vysokotlakého a nízkotlakého gradientu

Příklad gradientové separace Acquity H class

Efekt nastavení synchronizace startu gradientu s nástřikem vzorku.

Waters Corporation: Příklad gradientu Acquity H class

• A: Voda, B: ACN
• Průtok mobilní fáze 0,6 ml/min.
• Gradient má reálně zpoždění dané systémovým objemem.
• V tomto konkrétním příkladu cca 450 ul.

Waters Corporation: Příklad gradientu Acquity H class

• Nástřik vzorku a start gradientu mobilní fáze proběhl v čase „0“.
• Gradient podle zadání: (modrá)
• Reálný gradient (efekt „dwell volume“): (zelená)

Možnosti eliminace rozdílů systémového objemu HPLC/UPLC/UHPLC chromatografů

Použití funkce „Gradient Start“ umožňuje eliminovat rozdíl v systémovém objemu při transferu metod bez zásahu do psaného gradientu.

• „At injection“ (default nastavení)
• „Before injection“
• „After injection“

Waters Corporation: Použití funkce „Gradient Start“

Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu sub 2 um částice

Příklad separace s použitím eliminace systémového objemu.

1. Start gradientu a nástřiku v jednom okamžiku.
2. Gradient odstartován, po odčerpání 450 ul následuje nástřik vzorku.
3. Nástřik, gradient odstartován po odčerpání 450 ul

• Průběh gradientu dle instrumentové metody: (modrá)
• „Reálný“ průběh gradient: (zelená)

Waters Corporation: Příklad separace s použitím eliminace systémového objemu

Jak zjistit hodnotu systémového objemu

Waters Corporation: Jak zjistit hodnotu systémového objemu

• Line A: voda, Line B: 10 % THF voda, průtok: 1 ml/min
• Gradient: 0 min 100 % A, ve 2. minutě skoková změna na 100 % B, 3. min 100 % A
• Fluidické spojení: přes spojku
• Detekce 220 nm

Ukázka změření rozdílu hodnoty „dwell volume“ na systému Acquity H class

• Zelený záznam: injektor bez 50 ul extended loop.
• Červený záznam: nainstalována 50 ul ext. loop.

Waters Corporation: Ukázka změření rozdílu hodnoty „dwell volume“ na systému Acquity H class

Primitivním změřením pravítkem a přepočtem vzdálenosti mezi křivkami na objem (dle velikosti průtoku mobilní fáze)*: 45 ul

• Běžná tolerance na přesnost smyček je 15 % a nepřesnost měření malé vzdálenosti pravítkem.

Tip pro vývoj separačních podmínek

Waters Corporation: Tip pro vývoj separačních podmínek

Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu 3,5 um částice

Instrumentová metoda – gradientová tabulka W2695

Waters Corporation: Instrumentová metoda – gradientová tabulka W2695

• Separační modul W2695

1. Start I + G společně

• Průběh gradientu dle instrumentové metody: (zelená)
• „Reálný“ průběh gradient: (modrá)

2. Start G, po odčerpání 1000 ul proveden nástřik

Waters Corporation: Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu 3,5 um částice

Waters Corporation: Porovnání Acquity H class a W2695

Porovnání: W 2695 a Acquity H class

Waters Corporation: Porovnání W2695 a Acquity H class