Vliv systémového objemu na gradientovou separaci (VIZE 2021)
Waters Corporation: Vliv systémového objemu na gradientovou separaci (VIZE 2021)
Proč se liší separace směsi látek za identických podmínek na různých chromatografických systémech?
Chromatografické systémy mají rozdílnou specifikaci: Gradient delay volume (systémový objem)
Pojmy „dwell volume“, „void volume“ a ekvivalenty v češtině
Dwell volume (systémový objem)
Vnitřní objem fluidických cest chromatografického systému od místa, kde dochází k smísení složek mobilní fáze při tvorbě gradientu mobilní fáze až k místu injektáže vzorku.
Void volume (dead volume, mrtvý objem)
Objem mobilní fáze pro nezadržovanou složku v chromatografickém systému. Složka se pohybuje rychlostí mobilní fáze. Jsou to fluidické cesty (a volný objem v koloně) mezi injektorem a detektorem.
Vysokotlaký gradient
Tvorba vysokotlakého gradientu s použitím dvou čerpadel.
Waters Corporation: Vysokotlaký HPLC gradient
- (1) zásobníky mobilní fáze
- (2A,B) selekční ventily
- (3) hlavy čerpadla
- (4) písty čerpadla s pružinou
- (5) pohonná jednotka čerpadla s motorem
- (6) směšovač
- (7) směr toku mobilní fáze k vysokotlaké části systému
Nízkotlaký gradient
Tvorba nízkotlakého gradientu pomocí rychlého proporcionálního ventilu.
Waters Corporation: Nízkotlaký HPLC gradient
- (1) zásobníky mobilní fáze
- (2) gradientový proporcionální ventil
- (3) hlavy čerpadla
- (4) písty čerpadla s pružinou
- (5) pohonná jednotka čerpadla s motorem
- (6) směšovač
- (7) směr toku mobilní fáze
Systémový objem
Porovnání vysokotlaký vs. nízkotlaký gradient.
Waters Corporation: Porovnání vysokotlakého a nízkotlakého gradientu
Příklad gradientové separace Acquity H class
Efekt nastavení synchronizace startu gradientu s nástřikem vzorku.
Waters Corporation: Příklad gradientu Acquity H class
- A: Voda, B: ACN
- Průtok mobilní fáze 0,6 ml/min.
- Gradient má reálně zpoždění dané systémovým objemem.
- V tomto konkrétním příkladu cca 450 ul.
Waters Corporation: Příklad gradientu Acquity H class
- Nástřik vzorku a start gradientu mobilní fáze proběhl v čase „0“.
- Gradient podle zadání: (modrá)
- Reálný gradient (efekt „dwell volume“): (zelená)
Možnosti eliminace rozdílů systémového objemu HPLC/UPLC/UHPLC chromatografů
Použití funkce „Gradient Start“ umožňuje eliminovat rozdíl v systémovém objemu při transferu metod bez zásahu do psaného gradientu.
- „At injection“ (default nastavení)
- „Before injection“
- „After injection“
Waters Corporation: Použití funkce „Gradient Start“
Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu sub 2 um částice
Příklad separace s použitím eliminace systémového objemu.
- Start gradientu a nástřiku v jednom okamžiku.
- Gradient odstartován, po odčerpání 450 ul následuje nástřik vzorku.
- Nástřik, gradient odstartován po odčerpání 450 ul
- Průběh gradientu dle instrumentové metody: (modrá)
- „Reálný“ průběh gradient: (zelená)
Waters Corporation: Příklad separace s použitím eliminace systémového objemu
Jak zjistit hodnotu systémového objemu
Waters Corporation: Jak zjistit hodnotu systémového objemu
- Line A: voda, Line B: 10 % THF voda, průtok: 1 ml/min
- Gradient: 0 min 100 % A, ve 2. minutě skoková změna na 100 % B, 3. min 100 % A
- Fluidické spojení: přes spojku
- Detekce 220 nm
Ukázka změření rozdílu hodnoty „dwell volume“ na systému Acquity H class
- Zelený záznam: injektor bez 50 ul extended loop.
- Červený záznam: nainstalována 50 ul ext. loop.
Waters Corporation: Ukázka změření rozdílu hodnoty „dwell volume“ na systému Acquity H class
Primitivním změřením pravítkem a přepočtem vzdálenosti mezi křivkami na objem (dle velikosti průtoku mobilní fáze)*: 45 ul
- Běžná tolerance na přesnost smyček je 15 % a nepřesnost měření malé vzdálenosti pravítkem.
Tip pro vývoj separačních podmínek
Waters Corporation: Tip pro vývoj separačních podmínek
Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu 3,5 um částice
Instrumentová metoda – gradientová tabulka W2695
Waters Corporation: Instrumentová metoda – gradientová tabulka W2695
- Separační modul W2695
- Start I + G společně
- Průběh gradientu dle instrumentové metody: (zelená)
- „Reálný“ průběh gradient: (modrá)
- Start G, po odčerpání 1000 ul proveden nástřik
Waters Corporation: Efekt použití znalosti systémového objemu chromatografu 3,5 um částice
Waters Corporation: Porovnání Acquity H class a W2695
Porovnání: W 2695 a Acquity H class
Waters Corporation: Porovnání W2695 a Acquity H class
