LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Česká chromatografická škola
Česká chromatografická škola
Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.
Tagy
Článek
Akademie
Logo of LinkedIn

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

St, 8.6.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Při přenosu publikované HPLC metody na jiné pracoviště nebo z jedné instrumentzace na druhou nastávají mnohdy problémy s interpretací separace sledovaných analytů a nastává problém vůbec reprodukovat publikovanou metodu.

Typický příklad přenosu HPLC metody je ukázán na obrázku č.1.

HPLC.cz: Obr. 1 Přenos HPLC metody z jedné instrumentace na druhou. A – původní instrumentace, B – cílová instrumentaceHPLC.cz: Obr. 1 Přenos HPLC metody z jedné instrumentace na druhou. A – původní instrumentace, B – cílová instrumentace

Z obr. 1 je zřejmé, že nedochází k separaci analytů 5,6 a rozlišení Rs < 1,5.

Existuje několik příčin proč nedochází k dokonalé separaci:

  • a. chromatografický systém není dostatečně ekvilibrovaný
  • b. došlo ke změně chromatografické kolony
  • c. změna chromatografického (HPLC) systému
  • d. změna v chromatografickém postupu

Nedostatečnou ekvilibraci chromatografické kolony jako hrubou chybu vyloučíme a dále budeme rozebírat pouze poslední tři možné příčiny.

Desítky technických článků a praktických aplikací k přenosu metod také v knihovně LabRulezLCMS

1. Změna chromatografické kolony

Změnou kolony (jiný výrobce, jiná šarže) zpravidla dojde ke změně:

  • a. účinnosti kolony (počet teoretických pater, n)
  • b. selektivity (retenční poměr, r₁₂)

Proto je vhodné při validaci metody určit chromatografické parametry kolony, které vyhovují pro danou chromatografickou separaci:

  • a. účinnost kolony
  • b. selektivitu
  • c. silanolovou aktivitu

Jako výhodné se jeví Tanakovy testy chromatografických charakteristik stacionární fáze:

  • kapacita kolony (účinnost)

    • k pentylbenzenu, n pentylbenzenu
  • hydrofobicita HPLC.cz: - Výpočet hydrofobicityHPLC.cz: - Výpočet hydrofobicity

  • silanolová aktivita HPLC.cz: Výpočet silanolové aktivityHPLC.cz: Výpočet silanolové aktivity

a poté validovat metodu nejen na zvolené chromatografické koloně ale i určit vhodnou alternativní chromatografickou variantu. Používá se tzv. metoda maximální chromatografické variability, která zahrnuje:

  1. optimalizaci chromatografických podmínek
  2. předvídání použití různých chromatografických kolon
  3. výběr podobných kolon

1.1 Optimalizace chromatografických podmínek

Chromatografické podmínky se optimalizují tak, že se sleduje vliv teploty a složení mobilní fáze (% organické fáze nebo strmost gradientu) na Rs nebo r₁₂ a vícenásobnou regresí se získá Rs mapa akceptovatelných rozlišení při daných chromatografických podmínkách.

Pak při změně rozlišení Rs můžeme velmi jednoduše určit chromatografické podmínky, které budou vyhovovat požadovanému rozlišení.

Praktický příklad je patrný z obrázku č.2.

HPLC.cz: Obr. 2 Optimalizace chromatografických podmínek a aplikace na dvě stejné kolony různé šaržeHPLC.cz: Obr. 2 Optimalizace chromatografických podmínek a aplikace na dvě stejné kolony různé šarže

1.2 Variabilita chromatografických kolon

Obdobně jako u optimalizace chromatografických podmínek se optimalizují chromatografické kolony pro alternativní kolony a pak dostáváme nejen chromatografické podmínky pro používanou kolonu, ale i pro alternativní chromatografickou kolonu. Určením tzv. Rs map a jejich překryvem pro dvě různé kolony získáme ihned přehled, jak bude vypadat separace na alternativní koloně.

Praktický příklad je patrný z obrázku č.3.

HPLC.cz: Obr. 3 Variabilita chromatografických kolon a určení Rs mapHPLC.cz: Obr. 3 Variabilita chromatografických kolon a určení Rs map

1.3 Výběr podobných kolon

K celkové selektivitě stacionární fáze přispívají jednak kapacitní faktor k; a dále:

  • hydrofobicita (H)
  • stérická selektivita (shape selektivity; S)
  • silanolová aktivita (non-ionized silanol acidity nebo také silanol group capacity, A)
  • kolonová basicita (column basicity; B)
  • iontově-výměnná kapacita (cation-exchange capacity; C).

Pro logaritmus kapacitního faktoru pak platí:

HPLC.cz: Výpočet logaritmu kapacitního faktoruHPLC.cz: Výpočet logaritmu kapacitního faktoru

kde k, α, β, σ, a ν jsou příspěvky solutu a H, S, A, B a C jsou příspěvky stacionární fáze a kref je kapacitní faktor daný distribuční konstantou a fázovým poměrem.

Příspěvek hydrofobicity H souvisí s nespecifickými interakcemi solutu se stacionární fází (methylenová selektivita αCH2, příspěvky silanolové aktivity A a kolonové basicity B souvisí s možností tvorby vodíkových vazeb mezi solutem a zbytkovými silanolovými skupinami silikagelu.

Určením selektivity různých chromatografických kolon (Tanakovy a Engelhardtovy testy)(1), (2), (3) tak můžeme získat přehled o podobných kolonách, které je možné použít pak jako alternativní kolony ke koloně používané (validované).

Porovnání selektivity stacionárních fází podle Tanakových testů je ukázáno na obrázku:

HPLC.cz: Porovnání selektivity stacionárních fází podle Tanakových testůHPLC.cz: Porovnání selektivity stacionárních fází podle Tanakových testů

Další odkaz související s klasifikací kolon naleznete zde (Column Classification and Selection - Shimadzu).

Klasifikace HPLC kolon (stacionárnách fází) podle USP (HPLC column selection by USP listing).

2. Změna HPLC systému nebo HPLC procedury

Změna HPLC systému vede ve většině případech ke změnám:

  1. mrtvého objemu systému (při gradientu mobilní fáze)
  2. změna mimokolonových příspěvků k rozšíření chromatografické zóny

2.1 Mrtvý objem systému

Změna mrtvého objemu systému (konstrukce pumpy, změna vnitřního průměru kapilár) vede ke změně mrtvého objemu systému, která může mít vliv na strmost gradientu (zpoždění gradientu, které má vliv na separaci kritických analytů). Na separaci má vliv i tvorba gradientu – změna tvorby gradientu z nízkotlakého gradientu na vysokotlaký vede ke zpoždění gradientu a to má pak vliv na separaci kritických analytů.

2.2 Mimokolonové příspěvky

Mimokolonové příspěvky k rozšíření chromatografické zóny mají vliv na účinnost systému a změna objemu nástřiku, objemu cely detektoru, vnitřního průměru kapilár nebo jejich délky, může mít vliv na účinnost kolony a to vede ke snížení rozlišení kritických analytů.

3. Změna v chromatografickém postupu

Ke změně v chromatografickém postupu (metody) může dojít:

  • a. ve změně složení mobilní fáze (změna objemové frakce organického rozpouštědla, pH, koncentrace aditiv (pufry, iontové páry))
  • b. změnou teploty na chromatografické koloně
  • c. změnou gradientu (použití jiného tvorby gradientu, přechod z vysokotlakého gradientu na nízkotlaký a naopak)
Zdroje

(1) Ohtsu Y., Shioshima Y., Okumura T., Koyama J.-I., Nakamura O., Kimata K., Tanaka N.: J. Chromatogr. 481, 147 (1989).

(2) Engelhardt H., Arangio M., Lobert T.: LC-GC Int., 12 (1997).

(3) Engelhardt H.: Chromatographia 29, 59, (1990).

Česká chromatografická škola
Logo of LinkedIn
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)
Článek | Video

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)

Záznam odborné přednášky Marka Minárika (Watrex Praha) z veletrhu LABOREXPO 2024 na téma Streamline OLE 200 a Watrex xTrovert™ FLEX-O™ - Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi.
Watrex Praha
tag
share
more
Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF
Článek | Produkt

Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF

Pro nejnáročnější aplikace je určen nový Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, který do LC/MS přináší třetí separační rozměr: iontovou mobilitu v homogenním elektrickém poli (uniform field ion mobility).
Altium International
tag
share
more
Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku
Článek | Video

Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku

Aktivní účast HZSČR na NCT (Non-Conventional Threat) Europe 2024 s celotýdenní tréninkovou akcí s tématikou nástražných výbušných systémů, CBRN a speciálních sil armády a civilních složek.
Hasičský záchranný sbor ČR
tag
share
more
Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků
Článek | Produkt

Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků

Akreditované laboratoře ALS Czech Republic nabízí kompletní chemické, mikrobiologické a fyzikální rozbory studničních vod dle legislativních požadavků.
ALS Czech Republic
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)
Článek | Video

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)

Záznam odborné přednášky Marka Minárika (Watrex Praha) z veletrhu LABOREXPO 2024 na téma Streamline OLE 200 a Watrex xTrovert™ FLEX-O™ - Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi.
Watrex Praha
tag
share
more
Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF
Článek | Produkt

Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF

Pro nejnáročnější aplikace je určen nový Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, který do LC/MS přináší třetí separační rozměr: iontovou mobilitu v homogenním elektrickém poli (uniform field ion mobility).
Altium International
tag
share
more
Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku
Článek | Video

Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku

Aktivní účast HZSČR na NCT (Non-Conventional Threat) Europe 2024 s celotýdenní tréninkovou akcí s tématikou nástražných výbušných systémů, CBRN a speciálních sil armády a civilních složek.
Hasičský záchranný sbor ČR
tag
share
more
Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků
Článek | Produkt

Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků

Akreditované laboratoře ALS Czech Republic nabízí kompletní chemické, mikrobiologické a fyzikální rozbory studničních vod dle legislativních požadavků.
ALS Czech Republic
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)
Článek | Video

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)

Záznam odborné přednášky Marka Minárika (Watrex Praha) z veletrhu LABOREXPO 2024 na téma Streamline OLE 200 a Watrex xTrovert™ FLEX-O™ - Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi.
Watrex Praha
tag
share
more
Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF
Článek | Produkt

Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF

Pro nejnáročnější aplikace je určen nový Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, který do LC/MS přináší třetí separační rozměr: iontovou mobilitu v homogenním elektrickém poli (uniform field ion mobility).
Altium International
tag
share
more
Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku
Článek | Video

Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku

Aktivní účast HZSČR na NCT (Non-Conventional Threat) Europe 2024 s celotýdenní tréninkovou akcí s tématikou nástražných výbušných systémů, CBRN a speciálních sil armády a civilních složek.
Hasičský záchranný sbor ČR
tag
share
more
Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků
Článek | Produkt

Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků

Akreditované laboratoře ALS Czech Republic nabízí kompletní chemické, mikrobiologické a fyzikální rozbory studničních vod dle legislativních požadavků.
ALS Czech Republic
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Improved LC/MS Performance to Determine Polar Nitrosamines Using the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

SQ Detector 2

Brožury a specifikace
| 2024 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Ostatní

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)
Článek | Video

Záznam přednášky: Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, SPE) (Watrex Praha/LABOREXPO)

Záznam odborné přednášky Marka Minárika (Watrex Praha) z veletrhu LABOREXPO 2024 na téma Streamline OLE 200 a Watrex xTrovert™ FLEX-O™ - Nové možnosti automatizace extrakce na tuhé fázi.
Watrex Praha
tag
share
more
Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF
Článek | Produkt

Tři rozměry separace komplexních vzorků: Agilent 6560 Ion Mobility QTOF

Pro nejnáročnější aplikace je určen nový Agilent 6560 Ion Mobility QTOF, který do LC/MS přináší třetí separační rozměr: iontovou mobilitu v homogenním elektrickém poli (uniform field ion mobility).
Altium International
tag
share
more
Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku
Článek | Video

Hasiči z chemických laboratoří se zúčastnili mezinárodního CBRN tréninku v Chorvatsku

Aktivní účast HZSČR na NCT (Non-Conventional Threat) Europe 2024 s celotýdenní tréninkovou akcí s tématikou nástražných výbušných systémů, CBRN a speciálních sil armády a civilních složek.
Hasičský záchranný sbor ČR
tag
share
more
Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků
Článek | Produkt

Laboratorní rozbor studniční vody a interpretace výsledků

Akreditované laboratoře ALS Czech Republic nabízí kompletní chemické, mikrobiologické a fyzikální rozbory studničních vod dle legislativních požadavků.
ALS Czech Republic
tag
share
more
Další projekty
GCMS
ICPMS
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.