Tipy a triky v HPLC: Mrtvý objem kolony, systému a použití mixeru mobilní fáze v HPLC

Mrtvý objem chromatografické HPLC kolony a mrtvý objem systému

Mrtvý objem chromatografické kolony VM se zjišťuje jako retenční objem inertu o malé molekulové hmotnosti, o níž lze předpokládat, že pronikne do všech pórů náplně např.:

• benzen pro silikagel a dichlormethan jako mobilní fázi, aceton
• dusičnan sodný (1) pro reverzní fázi a acetonitril mobilní fázi.

Určení VM činí velké potíže a stanovení může být zatíženo systematickou chybou, která ovlivňuje přesnost určení kapacitních poměrů. Při vyhodnocování VM z chromatogramů je si třeba uvědomit, že určením VM se zjistí celkový mrtvý objem systému a nikoli pouze mrtvý objem kolony a pro exaktní výpočty se musí odečíst mrtvý objem systému:

• spojovací potrubí
• objem nástřikovacího zařízení
• objem cely detektoru

Na určení mrtvého objemu existuje několik způsobů, ale hodnověrnost získaných výsledků je neustále diskutabilní. (2) K určení objemu systému se nejlépe postupuje tak, že se ze systému vyřadí chromatografická kolona a nastříkne se do systému dobře detekovatelná látka (např. aceton, dusičnan sodný) při průtoku mobilní fáze (např. acetonitrilu) 1 ml/min. Sleduje se retenční objem látky, ze kterého se pak určí objem systému.

Z vlastní zkušenosti se mi pro určení mimokolonového objemu osvědčil následující postup: ze systému je vyřazena chromatografická kolona a pak je nastříknuto 10 µl 0,1 % roztoku acetonu při průtoku mobilní fáze (acetonitril) 1 ml/min. Experiment se opakuje 3krát a měří se čas od nástřiku po zaznamenání maximálního signálu acetonu v detektoru. Z naměřených výsledků a známého objemového průtoku mobilní fáze se vypočte průměrný mimokolonový objem systému.

Pro určení mrtvého objemu kolony byl použit stejný postup jako je popsáno výše, ale do systému byla zařazena chromatografická kolona a od zjištěné hodnoty mrtvého objemu kolony byl odečten mimokolonový objem systému. Mrtvý objem kolony je možné rovněž vypočítat přibližně z rovnice:

HPLC.cz: Výpočet mrtvého objemu kolony

kde průměrná porovitost náplně kolony ƐT = 0,70. Na výpočet můžete použít kalkulátor nebo se podívat do tabulek...

Rozměr kolony (vnitřní průměr x délka - dc x L (mm))) / Mrtvý objem kolony (ml)

• 1.0 x 100 mm / 0.06 ml
• 1.0 x 150 mm / 0.08 ml
• 1.0 x 250 mm / 0.14 ml
• 1.0 x 300 mm / 0.17 ml

• 2.1 x 100 mm / 0.24 ml
• 2.1 x 150 mm / 0.37 ml
• 2.1 x 250 mm / 0.61 ml
• 2.1 x 300 mm / 0.73 ml

• 3.9 x 100 mm / 0.83 ml
• 3.9 x 150 mm / 1.26 ml
• 3.9 x 250 mm / 2.08 ml
• 3.9 x 300 mm / 2.51 ml

• 4.6 x 100 mm / 1.16 ml
• 4.6 x 150 mm / 1.75 ml
• 4.6 x 250 mm / 2.90 ml
• 4.6 x 300 mm / 3.49 ml

• 7.8 x 100 mm / 3.35 ml
• 7.8 x 150 mm / 5.02 ml
• 7.8 x 250 mm / 8.36 ml
• 7.8 x 300 mm / 10.04 ml

• 10.0 x 100 mm / 5.50 ml
• 10.0 x 150 mm / 8.25 ml
• 10.0 x 250 mm / 13.75 ml
• 10.0 x 300 mm / 16.49 ml

• 21.0 x 100 mm / 24.25 ml
• 21.0 x 150 mm / 36.37 ml
• 21.0 x 250 mm / 60.61 ml
• 21.0 x 300 mm / 72.74 ml

Mrtvý objem systému HPLC zahrnuje veškerý objem chromatografu od chromatografického čerpadla až po výstup na kolonu. Určení mrtvého objemu má význam zejména při přenosu metody z jednoho instrumentu na druhý. Každý instrument má jiný mrtvý objem (Dead System Volume; DSV) a to hraje významnou úlohu při úpravě gradientové tabulky - tyto mrtvé objemy se musí korigovat tak, aby gradient byl na obou instrumentech stejný.

Určení DSV je jednoduché. Cesta A se naplní vodou, cesta B se naplní mobilní fází obsahující např. propylparaben a naprogramuje se gradient, kdy se do systému pumpuje pouze mobilní fáze A a po 5 minutách skokem mobilní fáze B. V 10 minutě opět skokem se systém vrátí na počáteční podmínky. Změna absorbance se projeví na chromatogramu a dostane se následující záznam:

HPLC.cz: Určení mrtvého objemu HPLC systému (DSV)

Otázka je v jakém místě odečítat "rozdíl" mezi naprogramovanou a pozorovanou změnou, nejčastěji je to v 50 % výšky.

Použití mixeru mobilní fáze v HPLC

Statický mixer se používá k míchání mobilních fází při použití nízkotlakého i vysokotlakého gradientu. U nízkotlakého gradientu se mixer zařazuje před vysokotlakou část před vstupem do chromatografické pumpy. U vysokotlakého gradientu se mixer zařazuje do vysokotlaké části HPLC systému za chromatografické pumpy. Mixer se také může zařadit při postkolonové derivatizace namísto T-kusu (resp. směšovací komůrky) – více naleznete zde.

Při výběru statického mixeru pro míchání mobilních fází jde především o kompromis mezi mrtvým objemem statického mixeru, šumem, který mixer vyvolá na základní linii a definicí gradientu (strmost gradientu a druh gradientu).

Na mixer jsou kladeny požadavky aby:

1. pro všechny dané průtoky zvýšil účinnost promísení mobilní fáze
2. snížil šum na základní linii
3. omezení zpoždění gradientu (menší mrtvý objem)
4. mrtvý objem systému byl minimální

Vysokotlaký gradient

Při použití vysokotlakého gradientu je nutné vybrat takový objem mixeru, aby byl jeho objem nižší než je průtok mobilní fáze (µl/min). To zajistí minimální šum na základní linii, mrtvý objem je snížen na minimum a zpoždění gradientu je minimální. Jako příklad jsou uvedeny objemy mixerů pro definované průtoky mobilní fáze.

Průtok mobilní fáze (ul/min) / Objem mixeru (ul)

• 0 - 5 ul/min / 2 ul
• 5 - 10 ul/min / 5 ul
• 10 - 25 ul/min / 10 ul
• 25 - 50 ul/min / 25 ul
• 50 - 150 ul/min / 50 ul
• 150 - 500 ul/min / 150 ul
• +500 ul/min / 250 ul

Nízkotlaký gradient

V tomto případě je požadovaný objem mixeru stanoven rychlostí nebo frekvencí gradientového ventilu na vstupu do vysokotlakého systému HPLC. Doporučuje se takový objem mixeru, který odpovídá průtoku mobilní fáze.

Průtok mobilní fáze (ul/min) / Objem mixeru (ul)

• 0 - 25 ul/min / 25 ul
• 25 - 50 ul/min / 50 ul
• 50 - 150 ul/min / 150 ul
• 150 - 500 ul/min / 250 ul
• +500 ul/min / 500 ul

Použití mixeru je ukázáno na příkladě použití statického mixéru o objemu 150 µl, který výrazně potlačí šum na základní linii oproti obyčejnému T-kusu při použití v postkolonové derivatizaci.

HPLC.cz: Ukázka použití statického mixéru o objemu 150 µl