<h3>Definice</h3>
Přenos (transfer) validované analytické metody je jedním z posledních kroků validačního cyklu metody z předávající do přijímací laboratoře. Transfer metody je v průmyslu součást technologického transferu výroby do jiného výrobního podninku. V současné době je transfer analytické metody plně integrován do životního cyklu analytické metody, zejména ve farmaceutickém průmyslu. (1), (2), (3)
Pro transfer metod existují směrnice státních autorit, bohužel pouze v obecném rovině a neupravují přesná akceptační kriteria a podmínky. (4)
<h3>Postup. Akceptační kriteria - Statistika</h3>
Transfer analyické metody zahrnuje několik kroků, které je možné vyjádřit v následujícím grafu:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Transfer_analyticke_metody_dfe54d4fa3/HPLC.cz-Transfer-analyticke-metody.png" alt="HPLC.cz: Postup a jednotlivé kroky při transferu analytické metody"/>
Při transferu metody pak stojíme před rozhodnutím jaké parametry metody při transferu sledovat a jak výsledky statisticky hodnotit. U statistického hodnocení se může jednat o:
<ul>
<li>a. Statistické testy významnosti</li>
<li>b. Statistické testy rovnocennosti</li>
<li>c. Statistické testy rozdílnosti</li>
</ul>
Nejčastěji jsou tzv. přístupy používajícího „jednoduchého srovnání“. Jsou definovány akceptační kritéria pro:
<ul>
<li>a. Opakovatelnost</li>
<li>b. Celkovou opakovatelnost</li>
<li>c. Rozdíl mezi průměry obou laboratoří</li>
<li>d. Rozdíl mezi celkovým průměrem a jednotlivými průměry</li>
</ul>
a dále pro linearitu metody. Předávající laboratoř musí nastavit systém suitability analytické metody, který musí přijímací laboratoř splnit.
Ukážeme si příklad pro jednoduché statistické porovnání ve farmaceutickém průmyslu pro stanovení obsahu. Při jednoduchém porovnání pak musí plati podmínka, že chyba procesu musí být srovnatelná s chybou metody (variabilitou analytickém procesu smax):
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Srovnani_chyby_procesu_s_chybou_metody_c6b02b3b08/HPLC.cz-Srovnani-chyby-procesu-s-chybou-metody.png" alt="HPLC.cz: Srovnání chyby procesu s chybou metody"/>
kde u může být odhadnut pro různé typy procesů. Například pro aktivní farmaceutické substance, kde je pouze množství nečistot je proces variability zanedbatelný a pak u = 0, pro lékovou formu je proces variability přibližně stejný jako pro analytickou variabilitu a pak u = 1.
Dále se stanoví maximální směrodatná odchylka metody, která je daná horním (SLupper) a dolním limitem (SLlower) obsahu:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Stanoveni_maximalni_smerodatne_odchylky_metody_f5c0491884/HPLC.cz-Stanoveni-maximalni-smerodatne-odchylky-metody.jpg" alt="HPLC.cz: Stanovení maximální směrodatné odchylky metody"/>
Pro jednotlivé parametry metody se vypočítají faktory, které závisí na počtu opakování a hladině významnosti. Tímto faktorem se pak násobí maximální povolená analytická variabilita smax čímž dostaneme hodnoty akceptačních kritérií. Pak dostaneme následující tabulku:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Akceptacni_kriterii_434e9ba380/HPLC.cz-Akceptacni-kriterii.jpg" alt="HPLC.cz: Akceptační kritérií"/>
Další možností statistického hodnocení metody je na základě <a href="https://lcms.cz/article/1734">nejistot měření</a> a tzv. En čísla (skóre). Uvedeme si malý příklad. Na základě tohoto hodnocení se porovnávají průměrné hodnoty předávající (A) a přijímací laboratoře (B), přičemž k těmto průměrům musí být přiřazena nejistoty měření (uA) a (uB). Pak platí:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Vypocet_En_cisla_skore_775afbbb33/HPLC.cz-Vypocet-En-cisla-(skore).jpg" alt="HPLC.cz: Výpočet En čísla (skóre)"/>
Pokud získáme výsledky uvedené v tabulce níže, můžeme učinit závěr, že laboratoře poskytují srovnatelné výsledky:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Vysledky_srovnani_36b1d8dc3f/HPLC.cz-Vysledky-srovnani.jpg" alt="HPLC.cz: Výsledky srovnání"/>
Přehled metodiky pro transfer analytických metod publikoval E. Rozet et.al. (5)

Transfer analytické metody

Metrologická konfirmace má za účel udržovat měřidlo v trvale validovaném stavu a má charakter opakované činnosti v pravidelných intervalech. Jedná se o soubor činností, potřebných k tomu, aby měřící zařízení vyhovovalo zamýšlenému používání.
Základem konfirmace je kalibrace měřidla. Konfirmaci měřidel by měla zajišťoat externí firma nebo pověřený pracovník, který musí splňovat určité kvalifikační požadavky. Konfirmace měřidel se provádí minimálně jednou ročně a dále vždy při vstupní kontrole měřidla (zakoupení měřidla; složitější opravy mající za následek dlouhodobé odstavení měřidla a vedoucí ke změnám jeho metrologických charakteristik); vypršení konfirmačního intervalu měřidla nebo při podezření na nesprávnost měření (změna přesnosti a správnosti měření).
<blockquote>
<ul>
<li><a href="https://lcms.cz/article/1698">Definice a problematika konfirmace</a>.</li>
</ul>
</blockquote>
<blockquote>
<ul>
<li><a href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Ceska_chromatograficka_skola_Konfirmace_HPLC_systemu_11dda65ee9/Ceska-chromatograficka-skola-Konfirmace-HPLC-systemu.pdf">Nabídku na konfirmaci HPLC</a>.</li>
</ul>
</blockquote>
<blockquote>
<ul>
<li><a href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Ukazka_konfirmacniho_protokolu_pro_konfirmaci_HPLC_linearita_teploty_kolonoveho_termostatu_4eb4a92b72/Ukazka-konfirmacniho-protokolu-pro-konfirmaci-HPLC-linearita-teploty-kolonoveho-termostatu.pdf">Ukázka konfirmačního protokolu pro konfirmaci HPLC</a> (linearita teploty kolonového termostatu).</li>
</ul>
</blockquote>
<h3>Modulární konfirmace</h3>
<h4>1. HPLC pumpa</h4>
<h5>1.1 Průtok</h5>
Konfirmuje se průtok HPLC pumpy pro průtok methanolu v ml/min.
<ul>
<li>Kriterium: Relativní odchylka od nastaveného průtoku Frel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Frel ≤ 1 %).</li>
</ul>
<h5>1.2 Těsnost pístů – tlakový test</h5>
Konfirmuje se těsnost HPLC pumpy po jejím natlakování jako relativní pokles tlaku v čase D p.
<ul>
<li>Kriterium: Průměr D p ze 3 měření nesmí být menší než 15 % relat.</li>
</ul>
<h4>2. Nástřikové zařízení - autosampler</h4>
Konfirmace autosampleru spočívá v kalibraci objemového nástřiku (µl), kalibraci linearity objemového nástřiku, detekce pozice vialky v karuselu a teplota pracovního prostoru.
<h5>2.1 Objem nástřiku</h5>
Objem nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku a vyjadřuje se jako relativní odchylka Vrel. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg.
<ul>
<li>Kriterium: Hodnota Vrel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Vrel ≤ 1 %).</li>
</ul>
<h5>2.2 Linearita nástřikového objemu</h5>
Linearita nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku pro různé objemové úrovně (např. 20 µl, 40 µl, 60 µl, 80 µl a 100 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a hmotnost nástřiku závisle proměnná, a koeficient korelace r. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg.
<ul>
<li>Kriterium: Hodnota Vrel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Vrel ≤ 1 %).</li>
<li>Kriterium: Nástřikový objem je lineární v případě, že korelační koeficient r ≥ 0,99.</li>
</ul>
<h5>2.3 Detekce pozice vialky v karuselu</h5>
Detekce pozice v karuselu spočívá v kontrole, zda autosampler správně nalezne předem určené pozice vialky v karuselu. Počet kontrol závisí na celkovém počtu míst karuselu a je roven druhé odmocnině z tohoto počtu tzn., že při celkovém počtu 120 míst se kontroluje 11 pozic (√120 = 10,95). Při kontrole se může začít od vialky číslo 1 a dále se postupuje na pozici vialky + 11 atd. nebo se postupuje sestupným způsobem tj. od poslední vialky (n - 11). Do určených pozic v karuselu se vloží vialky s novým septem (nebo se použije víčko s alobalem) a autosampler se naprogramuje tak, aby z těchto vialek (pozic) odebral nástřik o minimálním objemu s retenčním časem 0,1 min. Kontroluje se, zda je septum perforované.
<ul>
<li>Kriterium: Všechna septa musí být perforovaná.</li>
</ul>
<h5>2.4 Teplota pracovního prostoru</h5>
Tato zkouška se provádí pouze u chlazených dávkovačů. Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř chlazeného prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky dávkovače T₀.
<ul>
<li>Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.</li>
</ul>
<h4>3. UV Detektor</h4>
U nejběžněji dostupných detektorů, UV detektoru a fluorimetrického detektoru, se kalibruje nastavení vlnové délky na standardní roztok zvolené látky a zjišťuje se lineární dynamický rozsah detektoru.
<h5>3.1 Nastavení vlnové délky</h5>
Nastavení vlnové délky se konfirmuje pomocí roztoků se známým a charakteristickým absorpčním spektrem. Sejme se spektrum (scan) látky a musíme dostat charakteristické spektrum.
Je možné použít:
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPLC_cz_Konfirmace_nastaveni_vlnove_delky_af5c9389fe/HPLC.cz-Konfirmace-nastaveni-vlnove-delky.jpg" alt="HPLC.cz: Konfirmace nastavení vlnové délky"/>
<ul>
<li>Kriterium: Přípustná odchylka od těchto maxim je ± 2 nm.</li>
</ul>
<h5>3.2 Lineární dynamický rozsah</h5>
Mezi koncentrací složky v efluentu r M a intenzitou analytického signálu R (odezvou detektoru) je nejčastěji lineární vztah a v ideálním případě platí pro koncentrační detektor: R = k₁.rM, kde k₁ je konstanta úměrnosti, která zde vystupuje jako citlivost. Tento lineární vztah však neplatí pro všechny detektory. Lineární úsek závislosti log R proti hodnotám log r M* se nazývá lineární dynamický rozsah detektoru. Prakticky se postupuje tak, že připraví sada kalibračních roztoků definované látky o přesné koncentraci a sleduje se odezva detektoru v mV nebo absorbančních jednotkách na koncentraci. Metodou nejmenších čtverců se vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a odezva detektoru závisle proměnná, a koeficient korelace r.
<ul>
<li>Kriterium: Lineární dynamický rozsah detektoru je v oblasti, kdy se směrnice pohybuje v oblasti 0,98 až 1,02.</li>
</ul>
<h4>4. Termostat kolony</h4>
Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř kolonového prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky termostatu T₀. Měření se opakuje pro teplotu 20, 30 a 50 °C.
<ul>
<li>Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.</li>
</ul>
<h3>Validace systému</h3>
Po kalibraci jednotlivých modulů systému se konfirmuje celý systém, který zahrnuje všechny předchozí kroky.
<h4>1. Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze a objemového nástřiku</h4>
Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze se vypočte z reprodukovatelnosti retenčního času. Pokus se opakuje 8 krát a vypočte se relativní směrodatná odchylka (RSD) retenčního času a plochy píku.
<ul>
<li>Kriterium: RSD retenčního času se musí pohybovat &lt; 1 %, pro RSD plochy píku musí platit &lt; 1 %.</li>
</ul>
<h4>2. Linearita gradientu a průběh gradientu</h4>
Linearita a průběh gradientu se sleduje při programové změně gradientu UV detektorem při 270 nm na základě průchodu 0,1 % roztoku acetonu systémem. Vyjadřuje se jako relativní odchylka gradientu GREL a odchylka od linearity d %.
<ul>
<li>Kriterium: Pro relativní odchylku gradientu platí GREL &lt; 2 %.</li>
<li>Kriterium: Odchylka od linearity d % &lt; 2 %.</li>
</ul>
<h4>3. Linearita UV detektoru</h4>
Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na koncentraci. Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r. 
<ul>
<li>Kriterium: Předpoklad linearity detektoru je platný do koncentrace, kdy pro korelační koeficient platí r ≥ 0,999.</li>
</ul>
<h4>4. Linearita nástřiku</h4>
Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na objemu nástřiku (5, 10, 15, 20, 25 a 50 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r. Linearita objemového nástřiku se může provádět v případě, že linearita detektoru je vyhovující.
<ul>
<li>Kriterium: Předpoklad linearity nástřikového objemu je platný v případě, že korelační koeficient r ≥ 0,999.</li>
</ul>
<h4>5. Šum a drift detektoru</h4>
Detektorem se nechá protékat dobře odplyněná mobilní fáze o zvolené průtokové rychlosti. Nastaví se zvolená vlnová délka po ustálení se 60 minut zaznamenává základní linie. Vytiskne se záznam tak, aby bylo možné odečíst pravítkem maximální šum Nmax v rozmezí 5 minut a drift D za 60 minut.
<ul>
<li>Kriterium: šum Nmax 2.10⁻⁵, drift 1.10⁻⁴.</li>
</ul>
<h4>6. Křížová kontaminace</h4>
Připraví se kalibrační roztok zvolené látky o koncentraci 100 mg/l získané postupným ředěním základního roztokem mobilní fází. Objem nástřiku je 50 µl, nástřik se provede 2krát. Bezprostředně poté se na kolonu za stejných podmínek nastříkne 50 µl mobilní fáze.
<ul>
<li>Kriterium: V čase zvolené látky nesmí být nalezen pík této látky jehož výška je větší než trojnásobek šumu základní linie.</li>
</ul>

Konfirmace - Kvalifikace HPLC systému

Akademie

Článek

Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.

Česká chromatografická škola

Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod.

Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání. 

Validace analytických metod

Konzultace zahrnují odborné doporučení a rady během validace metody a statistické zpracování validačních dat. Vypracujeme validační zprávu.

Konzultace zahrnují odborné doporučení a rady během validace metody a statistické zpracování validačních dat. Dle požadavků zákazníka vypracujeme validační zprávu v českém i anglickém jazyce.

<h3>Validace</h3>
může být definována jako získání důkazu ve formě dokumentace, který poskytuje vysoký stupeň jistoty, že určitý proces bude trvale poskytovat produkt odpovídající předem určené specifikaci.
<h3>Validační parametry</h3>
upřesňují provozní charakteristiky metody a slouží k potvrzení správnosti a vhodnosti používání metody v provozním měřítku.
Navrhneme protokol a poskytneme konzultace pro validaci analytických metod na základě požadavků European Medicines Agency (EMA), The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) a nebo U.S. Food and Drug Administration (FDA).
Konzultace zahrnují odborné doporučení a rady během validace metody a statistické zpracování validačních dat. Dle požadavků zákazníka vypracujeme validační zprávu v českém i anglickém jazyce.

Validace analytických metod

Validace

Validační parametry

Novinky

Konfirmace - Kvalifikace HPLC systému

Transfer analytické metody

Aplikace (undefined)

Brožury (undefined)

Manuály (undefined)

Ostatní (undefined)