Konfirmace - Kvalifikace HPLC systému

Metrologická konfirmace má za účel udržovat měřidlo v trvale validovaném stavu a má charakter opakované činnosti v pravidelných intervalech. Jedná se o soubor činností, potřebných k tomu, aby měřící zařízení vyhovovalo zamýšlenému používání.

Základem konfirmace je kalibrace měřidla. Konfirmaci měřidel by měla zajišťoat externí firma nebo pověřený pracovník, který musí splňovat určité kvalifikační požadavky. Konfirmace měřidel se provádí minimálně jednou ročně a dále vždy při vstupní kontrole měřidla (zakoupení měřidla; složitější opravy mající za následek dlouhodobé odstavení měřidla a vedoucí ke změnám jeho metrologických charakteristik); vypršení konfirmačního intervalu měřidla nebo při podezření na nesprávnost měření (změna přesnosti a správnosti měření).

• Definice a problematika konfirmace.

• Nabídku na konfirmaci HPLC.

• Ukázka konfirmačního protokolu pro konfirmaci HPLC (linearita teploty kolonového termostatu).

Modulární konfirmace

1. HPLC pumpa

1.1 Průtok

Konfirmuje se průtok HPLC pumpy pro průtok methanolu v ml/min.

• Kriterium: Relativní odchylka od nastaveného průtoku Frel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Frel ≤ 1 %).

1.2 Těsnost pístů – tlakový test

Konfirmuje se těsnost HPLC pumpy po jejím natlakování jako relativní pokles tlaku v čase D p.

• Kriterium: Průměr D p ze 3 měření nesmí být menší než 15 % relat.

2. Nástřikové zařízení - autosampler

Konfirmace autosampleru spočívá v kalibraci objemového nástřiku (µl), kalibraci linearity objemového nástřiku, detekce pozice vialky v karuselu a teplota pracovního prostoru.

2.1 Objem nástřiku

Objem nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku a vyjadřuje se jako relativní odchylka Vrel. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg.

• Kriterium: Hodnota Vrel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Vrel ≤ 1 %).

2.2 Linearita nástřikového objemu

Linearita nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku pro různé objemové úrovně (např. 20 µl, 40 µl, 60 µl, 80 µl a 100 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a hmotnost nástřiku závisle proměnná, a koeficient korelace r. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg.

• Kriterium: Hodnota Vrel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak Vrel ≤ 1 %).
• Kriterium: Nástřikový objem je lineární v případě, že korelační koeficient r ≥ 0,99.

2.3 Detekce pozice vialky v karuselu

Detekce pozice v karuselu spočívá v kontrole, zda autosampler správně nalezne předem určené pozice vialky v karuselu. Počet kontrol závisí na celkovém počtu míst karuselu a je roven druhé odmocnině z tohoto počtu tzn., že při celkovém počtu 120 míst se kontroluje 11 pozic (√120 = 10,95). Při kontrole se může začít od vialky číslo 1 a dále se postupuje na pozici vialky + 11 atd. nebo se postupuje sestupným způsobem tj. od poslední vialky (n - 11). Do určených pozic v karuselu se vloží vialky s novým septem (nebo se použije víčko s alobalem) a autosampler se naprogramuje tak, aby z těchto vialek (pozic) odebral nástřik o minimálním objemu s retenčním časem 0,1 min. Kontroluje se, zda je septum perforované.

• Kriterium: Všechna septa musí být perforovaná.

2.4 Teplota pracovního prostoru

Tato zkouška se provádí pouze u chlazených dávkovačů. Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř chlazeného prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky dávkovače T₀.

• Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.

3. UV Detektor

U nejběžněji dostupných detektorů, UV detektoru a fluorimetrického detektoru, se kalibruje nastavení vlnové délky na standardní roztok zvolené látky a zjišťuje se lineární dynamický rozsah detektoru.

3.1 Nastavení vlnové délky

Nastavení vlnové délky se konfirmuje pomocí roztoků se známým a charakteristickým absorpčním spektrem. Sejme se spektrum (scan) látky a musíme dostat charakteristické spektrum.

Je možné použít:

HPLC.cz: Konfirmace nastavení vlnové délky

• Kriterium: Přípustná odchylka od těchto maxim je ± 2 nm.

3.2 Lineární dynamický rozsah

Mezi koncentrací složky v efluentu r M a intenzitou analytického signálu R (odezvou detektoru) je nejčastěji lineární vztah a v ideálním případě platí pro koncentrační detektor: R = k₁.rM, kde k₁ je konstanta úměrnosti, která zde vystupuje jako citlivost. Tento lineární vztah však neplatí pro všechny detektory. Lineární úsek závislosti log R proti hodnotám log r M* se nazývá lineární dynamický rozsah detektoru. Prakticky se postupuje tak, že připraví sada kalibračních roztoků definované látky o přesné koncentraci a sleduje se odezva detektoru v mV nebo absorbančních jednotkách na koncentraci. Metodou nejmenších čtverců se vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a odezva detektoru závisle proměnná, a koeficient korelace r.

• Kriterium: Lineární dynamický rozsah detektoru je v oblasti, kdy se směrnice pohybuje v oblasti 0,98 až 1,02.

4. Termostat kolony

Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř kolonového prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky termostatu T₀. Měření se opakuje pro teplotu 20, 30 a 50 °C.

• Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.

Validace systému

Po kalibraci jednotlivých modulů systému se konfirmuje celý systém, který zahrnuje všechny předchozí kroky.

1. Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze a objemového nástřiku

Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze se vypočte z reprodukovatelnosti retenčního času. Pokus se opakuje 8 krát a vypočte se relativní směrodatná odchylka (RSD) retenčního času a plochy píku.

• Kriterium: RSD retenčního času se musí pohybovat < 1 %, pro RSD plochy píku musí platit < 1 %.

2. Linearita gradientu a průběh gradientu

Linearita a průběh gradientu se sleduje při programové změně gradientu UV detektorem při 270 nm na základě průchodu 0,1 % roztoku acetonu systémem. Vyjadřuje se jako relativní odchylka gradientu GREL a odchylka od linearity d %.

• Kriterium: Pro relativní odchylku gradientu platí GREL < 2 %.
• Kriterium: Odchylka od linearity d % < 2 %.

3. Linearita UV detektoru

Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na koncentraci. Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r.

• Kriterium: Předpoklad linearity detektoru je platný do koncentrace, kdy pro korelační koeficient platí r ≥ 0,999.

4. Linearita nástřiku

Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na objemu nástřiku (5, 10, 15, 20, 25 a 50 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r. Linearita objemového nástřiku se může provádět v případě, že linearita detektoru je vyhovující.

• Kriterium: Předpoklad linearity nástřikového objemu je platný v případě, že korelační koeficient r ≥ 0,999.

5. Šum a drift detektoru

Detektorem se nechá protékat dobře odplyněná mobilní fáze o zvolené průtokové rychlosti. Nastaví se zvolená vlnová délka po ustálení se 60 minut zaznamenává základní linie. Vytiskne se záznam tak, aby bylo možné odečíst pravítkem maximální šum Nmax v rozmezí 5 minut a drift D za 60 minut.

• Kriterium: šum Nmax 2.10⁻⁵, drift 1.10⁻⁴.

6. Křížová kontaminace

Připraví se kalibrační roztok zvolené látky o koncentraci 100 mg/l získané postupným ředěním základního roztokem mobilní fází. Objem nástřiku je 50 µl, nástřik se provede 2krát. Bezprostředně poté se na kolonu za stejných podmínek nastříkne 50 µl mobilní fáze.

• Kriterium: V čase zvolené látky nesmí být nalezen pík této látky jehož výška je větší než trojnásobek šumu základní linie.