Comparison of Sub-3-μm HP-SEC Columns for the Analysis of IgG Antibody Aggregates (HMWS) and Fragments (LMWS)

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC) je základní technika pro hodnocení agregace a fragmentace monoklonálních protilátek (mAb) při vývoji a kontrole kvality biologických terapeutik. Analýza vysoce molekulárních (HMWS) a nízkomolekulárních (LMWS) forem zajišťuje bezpečnost, účinnost a stabilitu finálních produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat výkonnost nově optimalizované kolony Waters BioResolve SEC mAb (200 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm) s třemi komerčními sub-3 µm, 7.8×300 mm SEC kolony při separaci agregátů, monomerů a fragmentů terapeutické protilátky cetuximab.

Použitá metodika

Pro porovnání byla použita:

• Vodní standardní směs proteinů BEH200 SEC Protein Standard Mix.
• Odměřená mobilní fáze podle publikovaných protokolů jednotlivých výrobců.
• Analýza na Empower 3 řízeném ACQUITY UPLC H-Class Bio systému při 0,50 mL/min, 25 °C.
• Hodnocení: USP destičková účinnost (N), USP tailing, rozlišení (Rs) a poměr peak-to-valley (P/V).

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System řídicí software Empower 3.
• Waters BioResolve SEC mAb kolona, 200 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm (p/n 186009441).
• Tři komerční sub-3 µm, 7.8×300 mm SEC kolony označené X, Y, Z.

Hlavní výsledky a diskuse

• Účinnost: BioResolve kolona vykázala nejvyšší USP destičkovou účinnost a snížení redukovaného výškového parametru (h ≈ 2.87).
• Symetrie peaku: BioResolve a kolona Y dosáhly nejnižší hodnoty USP tailing (~1.0), což podporuje konzistentní separaci HMWS i LMWS.
• HMWS: Rozlišení monomerů a dimerů bylo srovnatelné na všech kolónách; větší pórovité kolony X a Z poskytly lepší separaci vyšších multimerů (HMWS2).
• LMWS2 (~50 kDa): BioResolve a kolona Y dosáhly baseline separace s identickými procenty plochy (0.11 %).
• LMWS1 (~100 kDa): Výrazně lepší oddělení na BioResolve (P/V = 4.98) oproti koloně Y (P/V = 1.24), což zajistilo přesnější kvantifikaci (0.48 % vs. 0.81 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Nová BioResolve SEC mAb kolona umožňuje robustní přenositelnost mezi HPLC, UHPLC a UPLC systémy bez nutnosti extrémně nízké extra-column disperze.
• Vyšší účinnost a symetrie peaků zlepšují přesnost a opakovatelnost kvantifikace agregátů i fragmentů mAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zdokonalování částic a povrchových chemických modifikací pro zvýšení účinnosti, zkrácení doby analýzy a minimalizaci disperze. Integrace s pokročilou softwarovou analýzou a umělou inteligencí přispěje k automatizované optimalizaci metod QC v biotechnologii.

Závěr

Waters BioResolve SEC mAb, 200 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm kolona prokázala vynikající účinnost, symetrii a rozlišení fragmentů a agregátů cetuximabu v porovnání s komerčními sub-3 µm kolónami. Metoda je vhodná pro široké spektrum chromatografických platforem a podporuje spolehlivou kontrolu kvality mAb terapeutik.

Reference

• Hong P., Koza S., Bouvier E. S. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2012, 35, 2923–2950.
• Cordoba A. J., Shyong B.-J., Breen D., Harris R. J. Non-Enzymatic Hinge Region Fragmentation of Antibodies in Solution. J. Chromatogr. B 2005, 818, 115–121.
• Koza S. M., Reed C., Chen W. Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Antibody Aggregates and Fragments: Selecting the Optimal Column Configuration for your Method. Waters Application Note 720006336EN, 2018.
• Fekete S., Guillarme D. Influence of Connection Tubing in Modern Size Exclusion Chromatography and its Impact on the Characterization of mAbs. J. Pharm. Biomed. Anal. 2018, 149, 22–32.
• Koza S. M., Chen W. High Resolution and High Throughput Size-Exclusion Chromatography Separations of IgG Antibody Aggregates and Fragments on UHPLC and HPLC Systems with 2.5 µm BEH Particles. Waters Application Note 720006522EN, 2019.