Examining the Structural Influence of Site-Specific Phosphorylation by Ion Mobility Mass Spectrometry

Význam tématu

Fosforylace je klíčová reversibilní posttranslační modifikace ovlivňující skládání a aktivitu proteinů. Význam určování míst a úrovní fosforylace se projevuje v základním výzkumu, vývoji biotechnologií i v diagnostice. Konvenční LC MS často selhává v rozlišení izobarických či isomerických fosfopeptidů. Zavedení iontové mobility hmotnostní spektrometrie IMS MS umožňuje separaci na základě kolizní plochy CCS, čímž se zvyšuje spolehlivost identifikace a lokalizace modifikací.

Cíle a přehled studie

Autoři navrhli kompletní automatizovaný protokol od enzymatického štěpení proteinů a obohacení fosfopeptidů až po analýzu na systému Agilent 6560 ion mobility LC Q TOF. Studie demonstruje:

• měření kolizní plochy jedním elektrickým polem single field CCS
• 4D extrakci signálních rysů zahrnující m z retenci drift čas a intenzitu
• porovnání fosforylovaných a nefosforylovaných peptidů se shodnými m z
• stanovení vlivu počtu a polohy fosforylací na strukturální konformace

Použitá metodika a instrumentace

Proces se skládal z:

• denaturace redukce alkylace a tryptického štěpení α a β caseinu pomocí platformy Agilent AssayMAP Bravo
• obohacení fosfopeptidů na Fe III NTA kartuších
• nanoflow LC separace s použitím Agilent Infinity UHPLC Nanodapter a 1290 II pumpy
• analýzy na Agilent 6560 ion mobility LC Q TOF se single field CCS kalibrací
• získání dat v režimu Alternating Frames umožňujícím souběžné MS a MS MS se stejnými drifovými časy
• využití softwaru MassHunter a IM MS Browser pro extrakci signálů výpočet CCS a identifikaci peptidů

Hlavní výsledky a diskuse

• fosfopeptidy vykazovaly kompaktnější konformace nižší CCS ve srovnání s nefosforylovanými peptidy stejného m z
• změny v počtu a pozici fosforylací způsobily významné rozdíly v CCS i separaci izomerických forem
• příkladem je peptid VNELSKDIGSESTEDQAMEDIK se dvěma či třemi fosforylacemi, kde IMS odhalila více konformací
• při jediném zorném poli analýzy single field bylo možné kalibrovat CCS lineární regresí bez nutnosti vícenásobných měření
• metoda Alternating Frames umožnila získat MS spektra MS MS fragmentaci a kolizní plochy v jednom průchodu analytu

Přínosy a praktické využití metody

Implementovaný workflow přináší:

• vysoce reprodukovatelné obohacení fosfopeptidů a přesná lokalizace modifikací
• zvýšenou schopnost rozlišovat izomerické peptidy na základě CCS
• zjednodušení datové akvizice díky souběžné MS a MS MS v režimu Alternating Frames
• možnost aplikace v proteomice farmaceutickém výzkumu QA QC biologik

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace IMS s pokročilými fragmentačními technikami a umělou inteligencí pro:

• automatizované rozpoznávání a kvantifikaci modifikací v komplexních vzorcích
• rozšíření rozsahu analyzovatelných biologicky aktivních molekul
• vývoj standardizovaných databází CCS pro lepší identifikaci
• mezifiremní validaci metodiky a komercializaci IMS MS platforem

Závěr

Popsaný celý workflow od vzorku ke struktuře poskytuje efektivní nástroj pro analýzu fosforylace peptidů. Kombinace obohacení fosfopeptidů single field CCS měření a Alternating Frames umožnila detailní mapování konformací a přesné stanovení místa modifikace v jediném běhu analýzy.

Reference

1. Russell J Murphy S Agilent AssayMAP Bravo Technology Enables Reproducible Automated Phosphopeptide Enrichment from Complex Mixtures Using HighCapacity FeIII NTA Cartridges Agilent Technologies Application Note 59916073EN 2016
2. Wu L Miller CA The Agilent Nanoadapter for Discovery Proteomics Using Nanoflow LC MS Agilent Technologies Application Note 59918174EN 2017
3. Mason EA McDaniel EW Transport Properties of Ions in Gases John Wiley and Sons New York 1988
4. Stow SM et al An Interlaboratory Evaluation of Drift Tube Ion MobilityMass Spectrometry Collision Cross Section Measurements Anal Chem 2017 89 90489055