Human Breast Cancer Cell Line Phosphoproteome Revealed by an Automated and Highly Selective Enrichment Workflow

Význam tématu

Phosphoproteomika je klíčová pro odhalení signálních cest a regulačních mechanismů v buňkách. Automatizovaná a vysoce selektivní obohacovací metodika zvyšuje reprodukovatelnost a propustnost experimentů, což je zásadní pro pokročilé proteomické analýzy ve výzkumu i průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo zhodnotit vliv poměru celkového množství peptidů k afinitnímu nosiči (sample/resin) na výkon a reprodukovatelnost obohacení fosfopeptidů. Studie využila tryptický digest lidské rakovinné linie MCF7, prespiked standardy lehkých izotopových fosfopeptidů, automatizované obohacení na platformě Agilent AssayMAP Bravo a následnou LC–MS analýzu pro objevnou proteomiku (Q-TOF) i kvantifikaci (triple quadrupole).

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizované obohacení: Agilent AssayMAP Bravo s vysokokapacitními Fe(III)-NTA cartridgemi.
• Příprava vzorků: digest MCF7 (125 µg) se čtyřmi různými sample/resin poměry, prespike 20 lehkých a následně 20 těžkých standardů.
• Separace a detekce pro objevnou proteomiku: Agilent 1290 Infinity II UHPLC s Nanodapter, nanoESI, Agilent 6550 iFunnel Q-TOF (DDA, datově závislá akvizice).
• Kvantifikace: Agilent 6495B triple quadrupole LC/MS v režimu MRM/DMRM řízeném Skyline pro výpočet výtěžku obohacení.

Hlavní výsledky a diskuse

Po obohacení se selektivita fosfopeptidů zvýšila z ~1,5 % na >90 % napříč 12 vzorky se čtyřmi poměry sample/resin. Identifikováno bylo 1 200–1 500 jedinečných fosfopeptidů při injekci 1 µg látky. Úspěšnost přiřazení fosforylačních míst dosahovala 55–60 %. Kvantifikace standardů ukázala průměrný výtěžek ~63 % s RSD <5 %, přičemž jednotlivé peptidy vykazovaly výtěžky od <10 % do ~100 %, ale v rámci metodiky konzistentní.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Agilent AssayMAP Bravo nabízí vysokou propustnost a robustnost obohacení fosfopeptidů s minimem manuálních zásahů. Integrované řešení pro objevnou i kvantitativní proteomiku umožňuje výzkumným laboratořím spolehlivě analyzovat komplexní proteomy, monitorovat fosforylační děje a standardizovat QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření obohacení na další posttranslační modifikace (glykozylace, ubiquitinace).
• Multiplexní analýzy s indexovanými standardy pro vysokou vzorkovou propustnost.
• Integrace strojového učení a umělé inteligence pro pokročilou interpretaci dat.
• Další automatizace a miniaturizace kapilárních systémů pro vysokou citlivost.

Závěr

Automatizovaný workflow Agilent AssayMAP Bravo s Fe(III)-NTA poskytuje vynikající selektivitu, reprodukovatelnost a propustnost pro objevné i kvantitativní fosfoproteomické studie. Systém je snadno implementovatelný v běžných výzkumných laboratořích a nabízí jednotnou platformu pro komplexní analýzu fosfoproteomů.

Reference

• Wu S., Wu L. Agilent AssayMAP Bravo Technology Enables Reproducible Automated Phosphopeptide Enrichment from Complex Mixtures Using High-Capacity Fe(III)-NTA Cartridges. Agilent Technologies 5991-6073EN, 2018.
• Sigma-Aldrich. PhosphoMix Standards. Dostupné z webu výrobce.
• Agilent Technologies. The Agilent Nanodapter for Discovery Proteomics Using Nanoflow LC/MS. Publication 5991-8174EN.
• Agilent Technologies. The Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS: Peptide Quantitation Performance. Publication 5991-6898EN.
• Agilent Technologies. Agilent Triple Quadrupole LC/MS Peptide Quantitation with Skyline. Publication 5990-9887EN.