Enhancing Phosphotyrosine Proteome Coverage using a Combined ETD and CID Approach on a LTQ Orbitrap XL ETD

Význam tématu

Tyrosinová fosforylace je klíčovým regulačním mechanismem v řadě buněčných procesů, jako je proliferace, diferenciace a migrace. Její nerovnováha je spojována s rakovinnými onemocněními a dalšími patologiemi. Přesná detekce a lokalizace míst tyrosinové fosforylace v proteomu je však náročná kvůli nízké zastoupenosti těchto peptidů a jejich dynamickému chování. Kombinace komplementárních metod fragmentace hmotnostní spektrometrie zvyšuje pravděpodobnost úspěšné identifikace a mapování těchto modifikací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat klasický přístup, kdy je každý peptid fragmentován oběma technikami CID a ETD, s inteligentním řízením fragmentace (data-dependent decision tree, DDDT). Studie využila pervanadizem stimulované HeLa buňky obohacené o fosfotyrosinové peptidy imunopurifikací a analyzované na přístroji LTQ Orbitrap XL ETD. Porovnání obou strategií mělo ukázat, zda řízený výběr vhodné metody fragmentace zvyšuje počet identifikovaných fosfotyrosinových peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidy byly získány štěpením proteinů z HeLa buněk ošetřených pervanadatem, následovala immunoaffinitní purifikace pomocí pY99 protilátek. Nanoflow LC separace proběhla na Agilent 1100 spojeném s trap a analytickým C18 sloupcem. Spektra byla akvizována na LTQ Orbitrap XL ETD v režimu vysokého rozlišení pro předvolné spektrum a v lineárním iontovém pastu pro CID/ETD. Data-dependent decision tree algoritmus směroval dvojí náboj k CID a vyšší náboje k ETD na základě m/z předkurzorů. Surová data byla zpracována v Proteome Discoverer, filtrace ETD spekter probíhala non-fragment filtrem, identifikace proběhla v Mascot hledání proti databázi Human IPI.

Hlavní výsledky a diskuse

V klasickém režimu bylo identifikováno 154 unikátních fosfotyrosinových peptidů, zatímco DDDT strategie odhalila 200 unikátních peptidů, což představuje ~30% nárůst. Pouze 13 % peptidů bylo společně detekováno oběma technikami, 128 bylo identifikováno výhradně CID a 51 pouze ETD. Vysoký podíl exkluzivních nálezů ukazuje, že ETD je klíčová pro peptidy s vyšším nábojem a zachováním labilních modifikací, zatímco CID vykazuje lepší účinnost na dvojitě nabitých peptidů. Ukázkové spektra demonstrovala komplementaritu obou přístupů a schopnost ETD generovat téměř úplné zbytky z-iónů pro dlouhé multicharged peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení pokrytí fosfotyrsinového proteomu až o třetinu díky inteligentní volbě fragmentační techniky.
• Využití ETD pro komplexní peptidy s vyšším nábojem vede k vysoké jistotě lokalizace modifikace.
• Rychlá on-the-fly determinace náboje a adaptivní volba CID/ETD šetří čas a zdroje v analýze složitých vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k pokročilým rozhodovacím stromům využívajícím strojové učení a reálná časová hodnocení kvality spekter. Integrace takových přístupů do pracovních postupů proteomiky umožní širší charakterizaci dráždivých signálních drah v biomedicíně. Kombinace s dalším obohacením a multifázovým tříděním vzorků dále zvýší citlivost pro detekci substoichiometrických modifikací.

Závěr

Inteligentní volba fragmentační metody pomocí DDDT na instrumentu LTQ Orbitrap XL ETD významně zvyšuje počet identifikovaných fosfotyrosinových peptidů oproti klasickému provedení. Komplementarita CID a ETD zajišťuje širší a spolehlivější pokrytí, což je zásadní pro detailní mapování signalizačních drah a biomedicínský výzkum.

Reference

1. Blume-Jensen P., Hunter T. (2001) Oncogenic kinase signalling. Nature 411:355-365.
2. Pinkse M.W. et al. (2008) Highly robust online TiO2-based phosphoproteomics in Drosophila melanogaster. J. Proteome Res. 7:687-697.
3. Ficarro S.B. et al. (2002) Phosphoproteome analysis by mass spectrometry in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Biotechnol. 20:301-305.
4. Van Hoof D. et al. (2009) Phosphorylation dynamics during differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 5:214-226.
5. Rush J. et al. (2005) Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nat. Biotechnol. 23:94-101.
6. Zhang Y. et al. (2005) Time-resolved mass spectrometry of EGFR signalling network. Mol. Cell. Proteomics 4:1240-1250.
7. Boersema P.J. et al. (2010) In-depth profiling of tyrosine phosphorylation. Mol. Cell. Proteomics 9:84-99.
8. Steen H. et al. (2002) Tyrosine phosphorylation mapping of EGFR pathway. J. Biol. Chem. 277:1031-1039.
9. Swaney D.L. et al. (2008) Decision tree-driven tandem mass spectrometry for shotgun proteomics. Nat. Methods 5:959-964.
10. Boersema P.J., Mohammed S., Heck A.J. (2009) Phosphopeptide fragmentation analysis. J. Mass Spectrom. 44:861-878.
11. Zeller M. et al. (2010) Increasing proteome coverage with ETD and CID using decision tree logic. Thermo Sci. App. Note 30179.