Agilent AssayMAP Bravo Technology Enables Reproducible Automated Phosphopeptide Enrichment from Complex Mixtures Using High‑Capacity Fe(III)‑NTA Cartridges

Význam tématu

Reverzní proteinová fosforylace reguluje klíčové buněčné signalizační dráhy a detailní studie fosfoproteomu vyžaduje cílenou obohacovací metodu.
Imobilizovaná metal-affinitní chromatografie (IMAC) s Fe(III)-NTA je vysoce selektivní, ale manuální postupy vykazují vysokou variabilitu a omezenou škálovatelnost.
Automatizace pomocí platformy Agilent AssayMAP Bravo slibuje reprodukovatelnost, snížení variability a snadné rozšíření pracovního postupu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnost a reprodukovatelnost automatizované obohacení fosfopeptidů z komplexních směsí pomocí vysoce kapacitních Fe(III)-NTA kazet na platformě AssayMAP Bravo.
Studie zahrnula optimalizaci chemie roztoků, objemů a průtokových rychlostí, měření kapacity kazet a validaci na krevním modelu (bovinní α-casein) i na kvasničných lysátech.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo s Phosphopeptide Enrichment v2.0 App
• AssayMAP Fe(III)-NTA kazety (5µL pryskyřice, >100nmol Fe(III))
• Agilent 1290 Infinity Binary LC
• AdvanceBio Peptide Mapping C18 kolony (2.1×150 nebo 2.1×250mm, 2.7µm)
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS s Dual JetStream ESI
• Software: Agilent MassHunter, Spectrum Mill, Skyline

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky bílkovin (α-casein, kvasničné lyzáty) byly redukovány, alkylovány a digesovány trypsinem.
Rozprašování a čištění peptidů v C18 kazetách před obohacením IMAC.
Automatizované obohacení: na kazety se nabíraly peptidové směsi v 80% ACN/0.1% TFA, následovalo omytí ve stejném pufru a eluce v 1% amoniaku (pH ~11).
Eluáty byly přímo přesměrovány do MS autosampleru se zředěním formiátem pro okamžitou acidifikaci.
LC/MS analýza: gradientní eluce 400µL/min, auto MS/MS Top10, data zpracována v Skyline a Spectrum Mill.

Hlavní výsledky a diskuse

Model α-casein: z 150µg peptidů obohaceno 31 phosphopeptidů s >92% selektivitou, eluce realizována v 4µL eluátu.
Kapacita kazet: pro α-casein ~150µg (~60nmol fosfátů). Peptidy bohaté na kyselé zbytky udržují vazbu až do vysokých zatížení.
Kvasnice: nejlepší výtěžek (~2 500 fosfopeptidů) a selektivita (>94%) dosažena v 80% ACN/0.1% TFA.
Snížení ACN pod 70% vede k nižšímu počtu identifikací kvůli protonaci fosforylovaných zbytků.
Mikropartikuláty peptidů snižují selektivitu; optimální je úplné rozpuštění a odstranění peptidového sedimentu.
Průtok při nabíjení ~3–5µL/min zajišťuje dostatečnou interakci peptidů s pryskyřicí, vyšší rychlost snižuje výtěžnost i selektivitu.
Reprodukovatelnost: čtyři paralelní enrichments z 500µg kvasničních digesátů poskytly průměrně 2 515 fosfopeptidů (CV 4,7%) a selektivitu 96,2% (CV 2,6%).

Přínosy a praktické využití metody

Platforma umožňuje simultánní zpracování 1–96 vzorků s minimální odbornou znalostí automatizace.
Řízená chemie a protokol přináší vysokou reprodukovatelnost a škálovatelnost pro výzkum fosfoproteomu.
Malé objemy eluce šetří vzorek a usnadňují přímou LC/MS analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na multiplexní kvantifikaci (TMT/iTRAQ) a integrované workflow s dalšími obohacovacími moduly (glykopeptidy, ubiquitiny).
Optimalizace pro nízkomnožstevní vzorky (klinické mikrobiopsie) a vzorky s nízkou phofofosforylací.
Integrace s online LC-autosamplerem pro plně automatizované vyhodnocení vzorků v reálném čase.

Závěr

Automatizované obohacení fosfopeptidů na platformě Agilent AssayMAP Bravo s Fe(III)-NTA kazetami poskytuje vysokou selektivitu, kapacitu a reprodukovatelnost.
Optimalizace složení roztoků, průtokové rychlosti a přípravy vzorků umožňuje obohatit tisíce fosfopeptidů z komplexních směsí.
Použitelnost pro široký rozsah aplikací od základního výzkumu po průmyslovou QA/QC a klinickou proteomiku.

Reference

1. Li S & Dass C. Anal. Biochem. 1999, 270:9-14
2. Posewitz MC & Tempst P. Anal. Chem. 1999, 71:2883-2892
3. Hart SR et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2002, 13:1042-1051
4. Ficarro S et al. Nat. Biotechnol. 2002, 20:301-305
5. Stensballe A & Jensen ON. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18:1721-1730
6. Barnouin KN et al. Proteomics 2005, 5:4376-4388
7. Kange R et al. J Biomol Tech. 2005, 16:91-103
8. Seeley EH et al. J Chromatogr B. 2005, 817:81-88
9. Ndassa YM et al. J Proteome Res. 2006, 5:2789-2799
10. Feng S et al. Mol Cell Proteomics 2007, 6:1656-1665
11. Imanishi SY et al. Proteomics 2007, 7:174-176
12. Jensen SS & Larsen MR. Rapid Commun Mass Spectrom. 2007, 21:3635-3645
13. Steen H et al. Cold Spring Harb Protoc. 2007
14. Feng S et al. Proteomics 2007, 7:351-360
15. Thingholm TE et al. Mol Cell Proteomics 2008, 7:661-671
16. Tsai CF et al. J Proteome Res. 2008, 7:4058-4069
17. Villen J & Gygi SP. Nat Protoc. 2008, 3:1630-1638
18. Ficarro SB et al. Anal Chem. 2009, 81:4566-4575
19. Swaney DL et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106:995-1000
20. Ye J et al. J Proteome Res. 2010, 9:3561-3573
21. Dephoure N & Gygi SP. Methods 2011, 54:379-386
22. Mertins P et al. Nat Methods 2013, 10:634-637
23. Zhu L et al. J Proteomics 2014, 96:360-365
24. Ruprecht B et al. Mol Cell Proteomics 2014
25. Holmes LD & Schiller MR. J Liq Chromatogr Rel Technol. 1997, 20:123-142
26. Larsen MR et al. Mol Cell Proteomics 2005, 4:873-886
27. Subirats X et al. Sep Purif Rev. 2007, 36:231-255
28. Bosch E et al. Anal Chem. 2000, 72:5193-5200
29. Espinosa S et al. J Chromatogr A. 1998, 824:137-146
30. Espinosa S et al. J Chromatogr A. 2002, 964:55-66
31. Swaney DL et al. Nat Methods. 2008, 5:959-964
32. Modler HW. J Dairy Sci. 1985, 68:2195-2205
33. Farrell HM Jr. et al. J Dairy Sci. 2004, 87:1641-1674