AdvanceBio HIC: a Hydrophobic HPLC Column for Monoclonal Antibody (mAb) Variant Analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují rostoucí třídu biotherapeutik, u nichž oxidativní modifikace aminokyselin, zejména methioninu, cysteinu a tryptofanu, snižuje biologickou aktivitu a stabilitu produktu. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) umožňuje separaci mAb variant v nativním, nondenaturovaném stavu při fyziologickém pH, čímž zachovává konformaci proteinu a odhaluje změny hydrofobního charakteru vzniklé oxidací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat schopnost kolony AdvanceBio HIC Agilent rozlišit oxidované formy standardního NIST mAb od nativního proteinu bez nutnosti štěpení na podjednotky. Studie zahrnovala:

• Umělé oxidace mAb pomocí tert-butylhydroperoxidu (t-BHP) a vodíkové peroxidu (H₂O₂).
• Optimalizaci podmínek gradientu a rychlosti průtoku pro maximální rozlišení variant.
• Časový monitoring oxidace metodou HIC.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky NIST mAb (1 mg/ml) byly inkubovány 24 h s 0,2 % (v/v) t-BHP nebo H₂O₂. Přebytek oxidantu odstraněn ultrafiltrací (10 kDa) a vzorky rekonstituovány v 50 % mobilní fáze B.

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC
• Bio-inert pumpa, multisampler s chlazením, multikolonní termostat a DAD detektor (220 nm).
• Software: Agilent OpenLab 2.2 CDS.

Chromatografické podmínky:

• Kolona: AdvanceBio HIC 4.6 × 100 mm.
• Mobilní fáze A: 50 mM fosfátový pufr, pH 7.0.
• Mobilní fáze B: 2 M síran amonný v 50 mM fosfátovém pufru, pH 7.0.
• Rychlost průtoku 0,3–0,5 ml/min, teplota 25 °C, injekční objem 5 μl.
• Gradient od 40–50 % A k 90–100 % A dle optimalizace.

Hlavní výsledky a diskuse

HIC umožnila rozlišení nativního mAb (nejdelší retenční čas) od oxidovaných forem:

• t-BHP vedlo k odlišení 6 oxidovaných šarží s kratšími retenčními časy.
• H₂O₂ vyvolalo méněčetné, ale agresivnější oxidace s 3 hlavními vrcholy.
• Snížení gradientní rychlosti a proudění (0,3 ml/min, 25 mM/min) zvýšilo rozlišení oxidovaných variant při zachování krátkého běhu.
• Časový monitoring s 2 % t-BHP ukázal postupné zvyšování počtu a šířky oxidovaných šarží, což odráží postupné oxidace povrchově orientovaných a následně vnořených Met zbytků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda AdvanceBio HIC nabízí:

• Rychlou a selektivní analýzu oxidativních PTM bez denaturace proteinu.
• Jednoduchou přípravu vzorku bez nutnosti enzymatického štěpení.
• Aplikovatelnost v QA/QC, stabilitních studiích a vývoji formulací bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření HIC metodiky o:

• Online coupling s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci modifikací.
• Automatizované vysokopropustné formáty pro screening stability mAb.
• Nové stacionární fáze a simulace konformačních změn pomocí výpočetních modelů.

Závěr

AdvanceBio HIC kolona v kombinaci s optimalizovaným gradientem a průtokem poskytuje spolehlivou platformu pro separaci a kvantifikaci oxidovaných variant monoclonálních protilátek, čímž přispívá ke zvýšení kvality a bezpečnosti bioterapeutik.

Reference

1. Zhang Y. et al. Anal. Chem. 2008, 80(18), 7022–7028.
2. Gaza-Bulseco G. et al. J. Chromatogr. B 2008, 870(1), 56–62.
3. Boyd D.; Kaschak T.; Yan B. J. Chromatogr. B 2011, 879(13–14), 955–960.
4. Fekete S. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016, 130, 3–18.
5. Chumsae C. et al. J. Chromatogr. B 2007, 850(1–2), 285–294.
6. Shen F. J. et al. Techniques in Protein Chemistry, Academic Press 1996, 7, 275–284.
7. Liu D. et al. Biochemistry 2008, 47(18), 5088–5100.