Analysis of Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates Using New Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) Columns

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) a protilátko-lékové konjugáty (ADC) představují důležitou třídu biologických léčiv s vysokou selektivitou a biokompatibilitou. Při výrobě i skladování dochází k tvorbě agregátů, fragmentů a oxidovaných forem, což může ovlivnit bezpečnost a účinnost. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) nabízí komplementární metodu k size exclusion a iontové výměně pro detailní charakterizaci této heterogenity.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit novou rodinu Thermo Scientific™ MAbPac™ HIC kolon navržených pro analýzu monoklonálních protilátek, jejich fragmentů, oxidovaných variant a ADC mimik. Prozkoumána byla selektivita, účinnost separace a návratnost pro různé typy mAb vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byly použity kolony MAbPac HIC-10 (5 µm, 4,6×100 mm), HIC-20 (5 µm, 4,6×100 a 4,6×250 mm) a HIC-Butyl (5 µm, 4,6×100 mm) s polyamidovými, amidovými či butylovými ligandy. Mobilní fáze obsahovaly (i) 2 M (nebo 1,5 M) sulfát amonný a 100 mM fosfát sodný pH 7, (ii) modifikace přídavkem isopropanolu (5–20 % v/v) pro zvýšení rozlišení. Analytický systém Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 BioRS sestával z SR-3000 solvent racku, LPG-3400RS pumpy, WPS-3000TBRS autosampleru, TCC-3000RS termokomory a VWD-3400RS detektoru.

Hlavní výsledky a diskuse

Agregáty monomer–oligomer byly efektivně odděleny na HIC-10 a HIC-20 kolonách s vysokou účinností a návratností. Papainem štěpené Fab a Fc fragmenty byly na HIC-20 rozlišeny pomocí optimalizovaných gradientů, včetně variant způsobených oxidacemi. Oxidované formy mAb (H2O2, AAPH) se na HIC-20 odlišily od neoxidovaných díky změně hydrofobnosti. Na HIC-Butyl koloně bylo úspěšně separováno ADC s různou mírou konjugace (DAR 0–8), přičemž vzrůstající DAR vedl k postupnému posunu retenčního času.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení a návratnost při analýze heterogenních populací mAb a ADC.
• Rychlé stanovení agregátů, fragmentů, oxidovaných forem a DAR rozložení.
• Důležitá podpora QC a vývoje bioterapeutik v průmyslových i akademických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace HIC s online hmotnostní spektrometrií pro přesnou identifikaci variant. Vícedimenzionální chromatografie (HIC × IEX nebo SEC) pro detailní profilaci. Vývoj nových ligandů a povrchových technologií, miniaturizace kolon pro PAT a průmyslové nasazení v reálném čase.

Závěr

Nové MAbPac HIC kolony ukazují vynikající schopnost separace monoklonálních protilátek a jejich modifikací. Díky třem ligandovým chemistriím a optimalizovaným mobilním fázím poskytují přehledné, rychlé a reprodukovatelné metody pro QC a výzkum biologických léčiv.

Reference

1. McCue JT et al. Bioprocess Biosyst Eng. (2008) 31, 261.
2. Lu Y et al. Curr Pharm Biotechnol. (2009) 10, 427.
3. Valliere-Douglass J et al. J Chromatogr A. (2008) 1214, 81.
4. Pan H et al. Protein Sci. (2009) 18, 424.
5. Ouyang J. Methods in Mol Biol. (2013) 1045, 275.