Agilent BioHPLC Columns - Characterization of NIST Monoclonal Antibody Critical Quality Attributes - Application Compendium

Význam tématu
Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu bioterapeutik, jejichž klinický a komerční úspěch závisí na striktní kontrole kritických kvality atributů (CQA). Způsob výroby a následné podmínky skladování vedou k heterogenitě biochemických forem, která může ovlivnit účinnost, stabilitu a bezpečnost léčivého přípravku. Proto je nezbytné uplatnit spolehlivé, reprodukovatelné a ortogonální analytické metody pro charakterizaci velikostních variant, nabíjecích forem, intactního hmotnostního profilu, podjednotek, peptidové mapy, glykosylace i nativních proteinů.

Cíle a přehled studie / článku
Cílem aplikovaného kompendia Agilent BioHPLC Columns je předvést rozsáhlé a vzájemně doplňkové analytické řešení měření kritických kvality atributů NIST Monoklonální Protilátky (NISTmAb RM 8671). Kompendium zahrnuje:

• analýzu agregátů a fragmentů pomocí Size Exclusion Chromatography (SEC),
• oddělení nabíjecích variant prostřednictvím iontově výměnné chromatografie (IEX),
• analýzu intactní hmotnosti a podjednotek metodou Reversed-Phase LC/MS,
• nativní separace proteinů technikou Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC),
• peptidové mapování s detailním LC/MS/MS protokolem,
• komplexní postupy pro charakterizaci N-glykanů.

Použitá metodika a instrumentace
Pro každou kategorii CQA byly optimalizovány oddělovací postupy, mobilní fáze a detekční techniky. Klíčové prvky instrumentace:

• SEC: Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC se 1,9–2,7 μm AdvanceBio SEC kolonkami (pory 120–300 Å),
• IEX: Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC v konfiguraci s Bio MAb (PEEK) cation exchange kolonkami a Buffer Advisor softwarem pro pH/sólniční gradienty,
• RP LC/MS: Agilent 1290 Infinity II UHPLC s PLRP-S wide-pore columnami a Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro vysokou přesnost intactní hmotnosti,
• AssayMAP Bravo: automatizace vzorkové přípravy, vykyselování, deamidace PNGase F, proteolýzy IdeS a redukce,
• HIC: Agilent AdvanceBio HIC kolony pro nativní oddělení PTM variant a agregátů,
• Data processing: Agilent OpenLAB CDS, MassHunter BioConfirm pro dekonvoluce a sekvenční ověřování intactních mAb a ADC.

Hlavní výsledky a diskuse
Size Exclusion Chromatography: Optimalizace pH mobilní fáze pro NISTmAb odhalila nejlepší separaci při 150 mM fosfátu pH 7,4 (As=1,41, Rs=2,78), HMW ~3 %. Zvýšením soli a úpravou pH bylo možno kontrolovat tvar a rozlišení dimerních forem.
IEX: pH-gradientní metodou na Bio MAb WCX kolonce bylo možné detailně rozčlenit kyselé a bazické varianty mAb s RSD RT <0,2 % a robustní opakovatelností rozlišení i obsahu každé frakce.
RP-LC/MS intactní mAb: Ve 4min gradientu PLRP-S wide-pore kolonkou bylo dosaženo vysoce kvalitních multiplitních iontových obálek a dekonvoluce s hmotnostní přesností <0,5 ppm pro hlavní glykofory NISTmAb i ADC s DAR=3,5.
Automatizace s AssayMAP Bravo: Kompletní workflow pro purifikaci mAb z kultivačního média, on-cartridge PNGase F a IdeS reakce a redukci generovalo vysoce čisté frakce intactní mAb, F(ab’)2, LC/HC subjednotek v celkem <6 h „walk-away“ režimu s mass accuracy <2–5 ppm.
HIC: Hydrofobní kolony AdvanceBio HIC nabídly nativní separaci oxidačních, deamidovaných a dalších PTM forem i agregátů, doplňující výsledky SEC, IEX a RP.

Přínosy a praktické využití metody
Komplexní portfólio Agilent BioHPLC řešení umožňuje:

• rutiní QA/QC testování mAb a biosimilars,
• rychlou reakci na změny výrobního procesu a porovnání šarží,
• integrovanou automatizaci pro vyšší propustnost a reprodukovatelnost,
• orthogonální přístup ke kritickým atributům

Budoucí trendy a možnosti využití

• další rozvoj nativních LC/MS metod se solventním přechodem na MS,
• nasazení dvourozměrné (2D) LC pro hlubší charakterizaci heterogenity,
• pokročilá automatizace vzorkových příprav a on-line monitoring procesů,
• swarm-inteligence pro návrh experimentů (DoE) v Buffer Advisor software

Závěr
Kombinace ortogonálních HPLC technik včetně SEC, IEX, RP, HIC a pokročilé LC/MS analýzy spolu s automatizací vzorkové přípravy tvoří robustní analytický rámec pro detailní a přesné sledování kritických kvality atributů mAb. Takový integrovaný přístup podporuje rychlý vývoj, validaci a kontinuální kontrolu bioterapeutik.

Reference
1. Schiel JE a kol. State‐of‐the‐Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization, Volume 2. ACS 2015.
2. Dell Farnan. Anal. Chem. 2009, 81, 8846–8857.
3. Turner A a kol. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2079–2093.
4. Mouchahoir T, Schiel JE. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2111–2126.
5. Zhang Q, Bateman KP. Bioanalysis 2016, 8(7), 649–659.
6. Beck A, Wagner‐Rousset E. Anal. Chem. 2013, 85(2), 715–736.