Quantitation of Oxidation Sites on a Monoclonal Antibody Using an Agilent 1260 Infinity HPLC-Chip/MS System Coupled to an Accurate-Mass 6520 Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Oxidace aminokyselin jako methionin, cystein a tryptofan v monoklonálních protilátkách může vést ke ztrátě aktivity a k změně vazebných vlastností bioterapeutik. Včasná identifikace a kvantifikace oxidačních míst je klíčová pro kontrolu kvality, stabilitu formulací a bezpečnost finálních produktů v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl prokázat použití systému Agilent 1260 Infinity HPLC‐Chip/MS ve spojení s Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS pro lokalizaci a relativní kvantifikaci oxidačních modifikací methioninových reziduí v monoklonální protilátce. Oxidace byla indukována různými koncentracemi t-butylhydroperoxidu (t-BHP), následoval tryptický rozklad, LC/MS analýza a statistické vyhodnocení dat.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity HPLC-Chip/MS s nano‐flow částí
• Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS
• Softwarové sady Agilent MassHunter Qualitative Analysis, BioConfirm, Comparative Analysis a MassProfiler Professional

Použitá metodika

Vzorky monoklonální protilátky byly inkubovány přes noc s 0–3 % t-BHP v pufru Tris-HCl (pH 7,5). Po vysušení proběhlo redukce, alkylace a tryptický rozklad (enzym:protein poměr 1:20). Peptidy byly separovány na mikrofluidním C18 chipu (ZORBAX 300SB-C18) gradientem 3–95 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí (celkem 36 min). Hmotnostní spektrometrie byla provozována v pozitivním módu (m/z 300–3200) s interní kalibrací a fragmentací pro MS/MS spektra. Data extrahovala funkce MFE a interpretovala BioConfirm; kvantifikace byla provedena porovnáním výšek iontových signálů oxidovaných a neoxidovaných peptidů; předběžné shlukování a diferenciaci úrovní oxidace zajišťovala PCA a statistická podpora MassProfiler Professional.

Hlavní výsledky a diskuse

• PCA jasně oddělila technické replikáty a ukázala gradující efekt t-BHP od kontroly po 3 % roztok.
• Met256 a Met432 vykazovaly výrazně vyšší oxidaci než Met84, což odpovídá jejich plošné expozici na povrchu molekuly.
• Oxidované peptidy elutovaly dříve (~7,7 min) než neoxidované (~9,0 min) díky větší polaritě sulfoxidu.
• Kontrolní vzorek obsahoval přirozenou oxidaci ~1 %, prokázanou kvantitativním výpočtem relativního procenta oxidace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou detekci a relativní kvantifikaci oxidačních modifikací na úrovni nízkých doporučených hmotnostních dávek (<50 ng) s minimální spotřebou vzorku a solventu. Rychlá chromatografie a vysoce přesné měření hmotnosti usnadňují screening stability protilátek již v raných fázích vývoje.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření přístupu na další post‐translační modifikace (deamidace, glykozylace).
• Integrace automatizovaných pracovních postupů a strojového učení pro rychlejší interpretaci dat.
• Uplatnění v rutinní kontrole kvality a validaci procesu výroby bioterapeutik.

Závěr

Demonstrace využití HPLC-Chip/MS a Q-TOF LC/MS pro lokalizaci a kvantifikaci oxidačních míst v monoklonální protilátce potvrdila vysokou citlivost, přesnost a reprodukovatelnost metody. Identifikace Met256 a Met432 jako klíčových náchylných míst poskytuje cenné informace pro optimalizaci formulací a výrobních postupů.

Reference

• Wang W. et al. Antibody structure, instability, and formulation. J. Pharm. Sci. 2007;96(1):1–26.
• Gaza-Bulseco G. et al. Effect of methionine oxidation of a recombinant monoclonal antibody on the binding affinity to protein A and protein G. J. Chromatogr. B. 2008;870(1):55–62.
• Shen J. et al. The application of tert-butylhydroperoxide oxidization to study sites of potential methionine oxidization in a recombinant antibody. In: Marshak D., editor. Techniques in Protein Chemistry VII. Academic Press; 1996. p. 275.
• Chumsae C. et al. Comparison of methionine oxidation in thermal stability and chemically stressed samples of a fully human monoclonal antibody. J. Chromatogr. B. 2007;850:285–294.