Intact Analysis Using Hydrophobic Interaction - Agilent BioHPLC Columns Application Compendium

Význam tématu

Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) umožňuje separaci terapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek (mAb) a jejich variant, v jejich původním, biologicky aktivním stavu. Díky zachování nativní konformace navíc otevírá možnost sběru frakcí pro následná bioassay a poskytuje komplementární pohled k technikám velikostní exclusivity, iontově-výměnné chromatografie a reverzní fáze.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost Agilent AdvanceBio HIC kolony v kombinaci s 1260 Infinity II Bio-inert LC systémem rozlišit a kvantifikovat oxidované varianty NISTmAb (referenční lidské IgG1k). Oxidace byla indukována buď tert-butylhydroperoxidem (t-BHP) nebo peroxidem vodíku (H2O2), aby se ověřila selektivita a citlivost metody.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografická metoda:

• Kolona: Agilent AdvanceBio HIC, 4,6 × 100 mm, 450 Å, 3,5 µm
• Mobilní fáze A: 50 mM fosfátový pufr, pH 7,0
• Mobilní fáze B: 2 M síran amonný v 50 mM fosfátovém pufru, pH 7,0
• Gradient: od 40–60 % B k 90–10 % B (25 mM/min), návrat k výchozím podmínkám a reekvilibrace 5 objemů kolony
• Průtok: 0,3–0,5 mL/min
• Teplota kolony: 25 °C; vzorkovač chlazen na 7 °C
• Detekce: DAD, 220 nm

Vzorky:

• NISTmAb při 1 mg/mL v nativním pufru
• Oxidace: 0,2 % (v/v) t-BHP nebo H2O2 za pokojové teploty po dobu 24 h
• Odstranění přebytku oxidačního činidla pomocí filtrů Amicon (10 kDa)

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC: pumpa, multisampler s chlazením, termoinkubátor, diodový array detektor s bio-inertními komponentami

Hlavní výsledky a diskuse

HIC chromatogramy ukázaly, že oxidované formy mAb se eluují dříve než nenarušená molekula. t-BHP vedl k postupné tvorbě šesti separovatelných oxidovaných variant (označených 1–6) a vrcholu 7 odpovídajícímu původnímu mAb. H2O2 způsobil téměř úplnou oxidaci s několika koelutujícími frakcemi. Pomalý gradient a nižší průtok (0,3 mL/min) významně zlepšily rozlišení oxidovaných forem během 40 min analýzy. Časová studie oxidace t-BHP prokázala postupný posun a zploštění piku při dlouhodobé oxidaci odpovídající konformačnímu nárůstu heterogenity.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a reprodukovatelnou analýzu oxidativních degradací mAb bez nutnosti denaturace, enzymatického štěpení nebo složitých přípravných postupů. Výsledky jsou využitelné pro:

• kvalitu a stabilitu léčivých protilátek (QC, stabilitní studia)
• monitorování posttranslačních modifikací
• oddělování a kvantifikaci oxidovaných variant pro bioassay a potenční korelace aktivity

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj HIC technik směřuje k:

• integraci s nativními MS pro přesné stanovení hmotností intaktních proteinů
• vylepšení povrchových chemických fází pro cílené rozlišení jednotlivých PTM
• automatizaci a validaci podle principů QbD
• použití v 2D LC systémech pro komplexní proteomickou charakterizaci
• miniaturizaci a vyšší průtoky pro screeningové aplikace

Závěr

Agilent AdvanceBio HIC kolona společně s 1260 Infinity II Bio-inert LC nabízí vysoce selektivní, robustní a reprodukovatelnou platformu pro separaci a kvantifikaci oxidovaných variant mAb v nativním stavu. Metoda je šetrná, časově efektivní a vhodná pro rutinní kontrolu kvality a výzkum biologických léčiv.

Reference

1. Zhang Y. et al. Anal. Chem. 2008, 80(18), 7022–7028.
2. Gaza-Bulseco G. et al. J. Chromatogr. B 2008, 850(1–2), 285–294.
3. Boyd D. et al. J. Chromatogr. B 2011, 879(13–14), 955–960.
4. Fekete S. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016, 130, 3–18.
5. Chumsae C. et al. J. Chromatogr. B 2007, 850(1–2), 285–294.
6. Shen F. J. et al. Techniques in Protein Chemistry, 1996, 7, 275–284.
7. Liu D. et al. Biochemistry 2008, 47(18), 5088–5100.