Robust and Reliable Peptide Mapping - The Agilent 1290 Infinity II Bio LC System as the new platform for UV and MS-based primary structure and PTMs analysis of mAbs

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčovou metodou pro charakterizaci primární struktury a posttranslačních modifikací monoklonálních protilátek. Robustní chromatografický systém a přesná detekce jsou nutné pro zajištění kvality biologických léčiv a splnění regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit schopnosti systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC pro vysoce reprodukovatelné peptidové mapování NISTmAb podle publikované metody a následně metodu optimalizovat tak, aby doba analýzy klesla o 60 % při zachování vysoké přesnosti.

Použitá metodika a instrumentace

V přípravě vzorku byla mAb denaturována, redukována, alkylována a potom trávena trypsinem. Původní metodu (Metoda A) s gradientem až 110 minut na kolóně AdvanceBio Peptide Mapping (2,1 × 250 mm, 2,7 µm) bylo možné replikovat s RSD retence pod 0,1 %. Optimalizovaná Metoda B využila kolónu ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2,1 × 150 mm, 1,8 µm) s gradientem 44 minut a rychlostí 0,3 mL/min. Analýza probíhala sekvenčně pomocí UV absorbance (214 nm) a LC/Q-TOF v iterativním MS/MS módu.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody dosahovaly průměrného RSD retence pod 0,1 %. Díky použití menších částic a optimalizaci gradientu se Metoda B zkrátila o 60 % při zachování vysoké separační kapacity (PC≈348) a vynikající reprodukovatelnosti. Přímé spojení Bio LC systému s LC/Q-TOF umožnilo spolehlivou identifikaci peptidů včetně konzervované peptidové sekvence PENNY a její deamidované formy.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce reprodukovatelné peptidové mapování s RSD retence pod 0,1 %
• Výrazné zkrácení doby analýzy bez ztráty kvality separace
• Snadná transferabilita metody mezi UV a MS detekcí pro vývoj i QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zkracování analýzních časů s použitím sub-2 µm částic a ultrarychlých gradientů, integrace automatizovaných kapalinových robotů pro přípravu vzorku či využití strojového učení pro analýzu komplexních dat z peptide mappingu představují budoucí směr vývoje.

Závěr

Systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC prokázal vysokou robustnost a přesnost pro UV i MS-založenou analýzu primární struktury a PTM mAb. Optimalizace metody umožnila výrazné zkrácení času analýzy a usnadnila přenos mezi vývojovým a produkčním prostředím.

Reference

• ICH Harmonised Tripartite Guideline Pharmaceutical Development Q6B, 1999
• Li X. et al. High Throughput Peptide Mapping Method for Analysis of Site Specific Monoclonal Antibody Oxidation, J Chromatogr A 2016;1460:51–60
• Li Y. et al. Characterization of Alanine to Valine Sequence Variants in the Fc Region of Nivolumab Biosimilar Produced in CHO Cells, MAbs 2016;8:951–960
• Wang T. et al. Quantitative LC-MS Multiattribute Method for Monitoring Glycan Heterogeneity on mAb, Anal Chem 2017;89:3562–3567
• Mouchahoir T.; Schiel J.E. Development of an LC-MS/MS Peptide Mapping Protocol for the NISTmAb, Anal Bioanal Chem 2018;410:2111–2126
• Chelius D.; Rehder D.S.; Bondarenko P.V. Identification and Characterization of Deamidation Sites in Conserved Regions of Human IgG, Anal Chem 2005;77:6004–6011