PEEK-lined columns and bio-inert supplies to complement the Agilent 1290 Infinity II bio LC system

Význam tématu

Bioterapeutické proteiny představují náročný analytický úkol z důvodu vysoké molekulární hmotnosti, složité struktury a četných post-translačních modifikací (PTM). Zajištění kvality těchto látek vyžaduje citlivé a přesné stanovení klíčových kvalitativních atributů (CQA) v nenarušeném i fragmentovaném stavu molekuly. Kovové povrchy v průtokové cestě mohou způsobovat artefakty, snižovat obnovu analyzátů a zkreslovat výsledky. Biokompatibilní, bio-inertní prvky cesty minimalizují tyto nežádoucí interakce a zvyšují spolehlivost analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem dokumentu je představit integrované řešení pro CQA monitoring bioterapeutik založené na soustavě Agilent 1290 Infinity II Bio LC a PEEK-výstelkových kolónách, které spolu s bio-inertními příslušenstvími eliminují kovové artefakty. Studie shrnuje konstrukční prvky systému, různé typy kolón pro SEC, reverzní fází, iontovou výměnu a HILIC, a ukazuje jejich výkon v aplikacích jako intact mass analysis, peptidové mapování či glykanová analýza.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: Agilent 1290 Infinity II Bio LC s vysokotlakým čerpadlem (až 1300 bar), multisamplerem s termostatizací, Quick Change ventily a Thermal Equilibration Device pro stabilní teplotu kolón.
• Detekce: volba mezi variabilní vlnovou délkou, diodovým polem, fluorescenční detektor a bio-MDS.
• Kolóny: PEEK-lined AdvanceBio SEC (1,9 µm, 120–200 Å), PLRP-S 1000 Å (5 µm), EC-C18 superficially porous, Poroshell 120 HILIC-Z PEEK-lined, HIC, IEX a glykanové fáze.
• Mass spectrometry: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro intact a native MS analýzy.
• Příslušenství: bio-inertní kapiláry MP35N, filtrační membrány (0,2 a 0,45 µm), Quick Connect spojky, ultranízkodisperzní sady.

Hlavní výsledky a diskuse

PEEK-lined kolóny významně omezují interakce s kovovými povrchy, což vede k:

• Vyšší obnově proteinu a peptidů ve srovnání se standardními nerezovými kolónami.
• Ostrým a symetrickým píkovým tvarům (PLRP-S: FWHM 0,112 vs 0,139, tailing faktor 2,33 vs 3,29).
• Eliminaci artefaktů u citlivých PTM (deamidace, oxidace) i u fosforylovaných nukleotidů (HILIC-DAD): až dvojnásobné zvýšení citlivosti a obnovy AMP, ADP, ATP.
• Možnosti práce v denaturačním režimu (apo-myoglobin) i v nativním režimu (holo-myoglobin) s přesnou dekonvolucí mas.
• Redukci doby primingu a spotřeby vzorku díky absenci aktivních kovových míst.

Přínosy a praktické využití metody

Bio-inertní LC cesta umožňuje laboratořím QA/QC a výzkumu:

• Snížit spotřebu vzorku a chemikálií díky vyšší citlivosti.
• Zkrátit čas přípravy a primingu kolóny.
• Zvýšit reprodukovatelnost analýz PTM a glykanových profilů.
• Zajistit robustní provoz i při použití agresivních mobilních fází (vysoká sůl, kolísající pH).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření biokompatibilních systémů pro vysokoprůtokové glykomické a proteomické analýzy, integrace on-line enzymatických štěpení a automatizovaných workflow podporovaných umělou inteligencí pro rychlou interpretaci dat. Dále poroste poptávka po jednorázových bio-inertních prvcích a kapilárách pro jednotková a klinická pracoviště.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II Bio LC v kombinaci s PEEK-lined AdvanceBio a Poroshell kolónami přináší komplexní řešení pro přesný monitoring CQA bioterapeutik. Odstranění kovových komponent v průtokovém systému zvyšuje citlivost, zlepšuje tvar píků a zkracuje dobu přípravy, což podporuje efektivní a spolehlivou kontrolu kvality.

Reference

• Sandra K. et al. HPLC-DAD Analysis of Nucleotides Using a Fully Inert Flow Path. Agilent Application Note, 2021.