Peptide Mapping and Quantitation of Oxidation and Deamidation in Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčový nástroj v bioterapeutikách a jejich účinnost závisí na zachování struktury a funkce. Peptidové mapování umožňuje detailní ověření sekvence a lokalizaci posttranslačních modifikací, jako je oxidace a deamidace. Monitoring těchto změn je zásadní pro zajištění kvality, bezpečnosti a stability léčiv.

Cíle a přehled studie

V aplikaci bylo představeno integrované řešení pro identifikaci sekvenčních oblastí mAb a kvantifikaci chemicky indukované oxidace a deamidace. Studie porovnala dvě vzorky mAb (NISTmAb a rituximab) za různých podmínek stresu a vyhodnotila reprodukovatelnost metody.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizace přípravy vzorků:

• Agilent AssayMAP Bravo: redukce, alkylace, trypsinová digesce a čištění peptidů

Separační a detekční technika:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC s AdvanceBio Peptide Mapping kolónou
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI

Softwarová analýza:

• MassHunter VWorks 14.1 pro řízení automatizace
• MassHunter BioConfirm 12.1 pro identifikaci peptidů a kvantifikaci PTM

Hlavní výsledky a diskuse

Oxidace:

• Metioniny M255 (Fc těžký řetězec) a M4 (světlý řetězec) v NISTmAb a analogické M256 v rituximabu vykázaly rostoucí míru oxidace s rostoucí koncentrací H2O2 (0,002–0,2 %)
• Vysoce reprodukovatelné výsledky s nízkou standardní odchylkou (< 2,5 %)

Deamidace:

• Peptid NQVSLTCLVK vykazoval tři formy deamidace rozlišené chromatograficky
• Software BioConfirm přiřazoval modifikace na základě MS/MS skóre a přesně lokalizoval deamidaci na Q365 a N364

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup zkracuje dobu přípravy a analýzy, snižuje riziko kontaminace a zvyšuje opakovatelnost výsledků. Metoda umožňuje přesné sledování PTM, což usnadňuje optimalizaci formulace a kontrolu kvality bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na rozšíření spektrometrických technik pro vyšší citlivost detekce vzácných modifikací, integraci s AI-řízenou analýzou dat a automatizovanou validaci výsledků. Možné aplikace zahrnují personalizovaná terapeutika a real-time monitoring stability přípravků během výroby.

Závěr

Prezentovaná workflow ukázala robustní a reprodukovatelnou metodiku pro peptidové mapování a kvantifikaci oxidace i deamidace mAb. Kombinace automatizované přípravy a pokročilé LC-MS analýzy spolu se sofistikovaným softwarem umožňuje spolehlivou charakterizaci bioterapeutik.

Reference

• ICH Q6B: Testovací postupy a akceptační kritéria pro biotechnologické/biologické produkty
• Gupta S. et al.: Oxidace a deamidace mAb – dopad na stabilitu a aktivitu, J. Pharm. Sci. 2022, 111(4), 903–918
• Bovee M. et al.: Automatizace přípravy vzorků pro charakterizaci bioproteinů, Agilent App. Note 5991-4872EN, 2016
• Haberger M. et al.: Chemické modifikace v CDR rekombinantních protilátek, mAbs 2014, 6(2), 327–339