Glycan Analysis - Agilent BioHPLC Columns Application Compendium

Význam tématu

Charakterizace N-vázaných glykosidických řetězců (N-glykanů) na terapeutických protilátkách je klíčová pro hodnocení kritických kvalitativních atributů (CQA) bioterapeutik. Struktura glykosylace ovlivňuje farmakokinetiku, účinnost, imunogenicitu a stabilitu proteinů. Moderní analytické přístupy spojují vysokorozlišovací chromatografii, fluorescenční značení a hmotnostní spektrometrii, aby poskytly komplexní pohled na diverzitu a relativní kvantifikaci glykosidů.

Cíle a přehled studie / článku

Text představuje kompendium aplikací Agilent technologií a standardu NISTmAb pro analýzu N-glykanů:

• Úvodní popis významu glykosylace a role HILIC separací
• Technické detaily sloupců AdvanceBio Glycan Mapping (1,8 μm UHPLC a 2,7 μm HPLC formáty)
• Rychlé startovací návody pro optimální chromatografické podmínky
• Ukázky aplikací (glykopeptidová charakterizace, komplexní workflow od přípravy po data mining, fluorescenční a MS detekce, porovnání kvantifikace, expresní značení 2-AB)

Použitá metodika a instrumentace

• Přístroje: Agilent 1290 Infinity II LC, 1260 Infinity Bio-Inert / Multisampler, 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF, LC/MSD XT single quad
• Kolony: AdvanceBio Glycan Mapping amide-HILIC (1,8 µm, 2,7 µm); AdvanceBio Peptide Mapping (RP-C18)
• Detekce: fluorescenční detektor (ex 260–285 nm / em 430–345 nm) a MS s Agilent Jet Stream ESI
• Příprava vzorku: automatizovaný ruční či robotický workflow (AssayMAP Bravo), enzymatické uvolnění PNGase F, značení 2-AB nebo InstantPC, HILIC-on-matrix či kapilární vyplachování
• Software: MassHunter BioConfirm, Qualitative Analysis, Mass Profiler, PCD databáze glykánů

Hlavní výsledky a diskuse

• HILIC separace výrazně zlepšuje rozlišení glykosidů oproti RP–C18, zejména hydrofilních glykopeptidů
• InstantPC značení zvýšilo ionizační účinnost pro MS a umožnilo detekci minoritních glykanů (<0,5 % relativního zastoupení)
• Glykopeptidová analýza Q-TOF má dostatečnou jemnost pro lokalizace glykanů na specifických asparaginových pozicích
• Komplexní workflow spojil přípravu (Gly-X, 2-AB Express), UHPLC-FLD a LC/Q-TOF pro rychlou kvantifikaci i strukturní identifikaci
• MS data slouží k rozlišení izobarických párových glykánů, tandemová MS potvrdila modifikace jako NeuGc či α-galaktózu
• Porovnání kvantifikace FLD vs. MS (peak area) ukázalo vysokou korelaci (RSD < 5 %), MS navíc zpřístupnila větší počet detekovaných forem
• Rychlý protokol 2-AB Express umožňuje přípravu vzorku do 2 h, oproti původním 16–24 h

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace přípravy vzorků (AssayMAP Bravo) zvyšuje reprodukovatelnost a throughput v QA/QC laboratořích
• HILIC sloupce poskytují stabilní a reprodukovatelné rozlišení N-glykanů pro různé mAb produkty
• InstantPC / 2-AB značení je kompatibilní s historickými daty, přičemž rozšiřuje analytické možnosti o MS identifikaci
• MSD XT single quad hyfenovaný on-line k FLD LC nabízí nákladově výhodné řešení pro rutinní kontroly
• Software BioConfirm a Mass Profiler umožňují rychlé vyhodnocení glyco-profilů a reportování ve standardizovaném formátu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace ultrarychlých UHPLC-MSMS a modulárních robotických platforem pro masivní paralelní zpracování (high-throughput glycomics)
• Rozvoj nových derivatizačních reagentů zvýrazňujících specifické glykanové struktury pro hlubší rozlišení izomerů
• Pokročilá datová analýza a strojové učení pro predikci glykozylace na základě bioprocesních parametrů
• Standardizace glykanových referenčních materiálů (NISTmAb) pro mezinárodní farmaceutický průmysl

Závěr

Komplexní portfolium Agilent metod a instrumentace společně s NISTmAb standardem umožňuje detailní, reprodukovatelné a vysoce citlivé analýzy N-glykanů. Workflow od rychlé přípravy přes optimalizované HILIC separace až po MS-aided identifikaci či porovnání FLD vs. MS kvantifikace poskytuje robustní platformu pro vývoj, validaci a kontrolu bioterapeutik.

Reference

• Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
• Reusch D., Tejada M. L. Glycobiology 2015, 25(12), 1325–1334.
• Mellquist J. L. et al. Biochemistry 1998, 37(19), 6833–6837.
• Ghaderi D. et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2012, 28, 147–175.
• Prien J. M. et al. ACS Symposium Series 2016, 185–235.