Hydrophobic Interaction Chromatography- Native Mode Separation of Bio-Therapeutic Workflows

Význam tématu

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) představuje klíčovou techniku pro separaci a purifikaci bílkovin v nativním stavu. Umožňuje zachovat jejich biologickou aktivitu a zároveň rozlišit varianty monoclonálních protilátek (mAb) a konjugáty protilátka–lék (ADC) na základě rozdílů v hydrofobicitě.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo ověřit výkonnost nové kolony Agilent AdvanceBio HIC při analýze oxidovaných variant mAb a stanovení poměru lék/protilátka (DAR) u ADCs za nativních podmínek. Studie rovněž ilustruje integraci HIC s 2D-LC/MS a inertním HPLC systémem pro bioterapeutika.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika využívá nativní mobilní fáze s vysokou koncentrací amoniového síranu a pufrem sodného fosfátu (pH 7,0). Pro separaci oxidovaných mAb byla použita kolona AdvanceBio HIC 4,6×100 mm (3,5 µm, 450 Å) a pro rychlou analýzu ADC menší kolona 4,6×30 mm. Gradient se pohybuje od 50 % pufru k 75 % soli s přídavkem propan-2-olu. Inj. objem 5 µL, průtok 0,3–0,5 mL/min, teplota 25 °C, detekce UV při 220 nm. Oxidace mAb probíhala v přítomnosti 2 % tert-butyl hydroperoxidu (t-BHP) při různých časech (0–600 min).

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC
• Agilent 1290 Infinity 2D-LC
• Agilent 6224 TOF MS

Hlavní výsledky a diskuse

Projekt 1: Oxidace mAb pomocí t-BHP vedla k vytvoření lazšího vrcholu elujícího o ~0,5 minuty dříve než neošetřený vzorek. 2D-LC/MS potvrdila navýšení hmotnosti o 64 Da, odpovídající oxidaci čtyř Met reziduí.
Projekt 2: Analýza ADC (brentuximab vedotin) ukázala výrazné zkrácení doby separace na 8 minut s malou kolonou a 24 minut s velkou. Stanovená hodnota DAR ≈ 4,04 byla v souladu s očekávanou distribucí.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita pro nativní varianty mAb a ADC
• Zkrácení doby analýzy až trojnásobně u menší kolony
• Kompatibilita s vysokými koncentracemi solí a bio-inertním systémem
• Přímé stanovení DAR bez denaturace vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HIC s 2D-LC/MS pro detailní charakterizaci posttranslačních modifikací
• Vývoj MS-přátelských solných protokolů pro přímou hyphenaci
• Rozšíření aplikace na další bioterapeutika (enzymy, rekombinantní proteiny)
• Automatizace workflow pro rutinní QA/QC laboratoře

Závěr

Kolony Agilent AdvanceBio HIC spolu s bio-inertním LC a 2D-LC/MS systémem prokázaly vynikající výkon pro nativní separaci oxidovaných variant mAb i stanovení DAR u ADC. Metoda nabízí rychlou, citlivou a šetrnou analýzu biomolekul.

Reference

1. Fekete S., Veuthey J. L., Beck A., Guillarme D. Hydrophobic interaction chromatography for the characterization of monoclonal antibodies and related products. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016, 130, 3–18.
2. Staples G. Analysis of monoclonal antibodies using MHC 2D-LC/MS. Agilent Technologies Application Note 5991-6376EN, 2014.
3. Coffey A., Kondaveeti S. An AdvanceBio HIC Column for Drug-to-Antibody Ratio (DAR) Analysis of Antibody Drug Conjugates (ADCs). Agilent Technologies Application Note 5994-0149EN, 2018.