Why Use HILIC and HIC Chromatography?
Prezentace | 2024 | Agilent TechnologiesInstrumentace
Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a chromatografie na bázi hydrofilních interakcí (HILIC) představují doplňující režimy k běžné reverzní fázi (RPLC). HILIC umožňuje spolehlivou retenci velmi polárních a ionizovatelných látek, zatímco HIC zajišťuje separaci proteinů v jejich nativní formě bez denaturace.
Článek shrnuje teoretické principy HILIC a HIC, popisuje vývoj metodik a strategie optimalizace. Ukazuje výběr vhodných kolon, mobilních fází a gradientních protokolů pro široké spektrum analytů od aminokyselin a cukerných struktur až po monoklonální protilátky.
Metodika HILIC staví na adsorpci vodného filmu na polární povrch a rozdělení na základě polarity a iontově-výměnných interakcí. HIC využívá vysokou koncentraci soli k potlačení elektrostatických účinků a eluci proteinů postupným snižováním iontového sílení. K měření se používají bio-inertní LC systémy Agilent, kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC a AdvanceBio HIC, detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD a hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ a Ultivo LC/TQ.
V HILIC režimu se eluce řídí obráceně oproti RPLC a dosahuje se lepší separace izobarických a vysoce polárních sloučenin. Úprava podílu akrylonitrilu, pH a pufrovací soli dramaticky mění retenci i selektivitu. AdvanceBio HIC kolony umožňují detailní analýzu intact mAb, jejich fragmentů, posttranslačních modifikací, oxidovaných variant a DAR u ADC. Online 2D-LC/MS spojení HIC a RP eliminuje problémy se solí a zjednodušuje identifikaci neznámých složek.
Propojení HILIC a HIC v multidimenzionálních platformách 2D-LC nabídne komplexní pohled na extrémně složité vzorky. Vývoj nových bio-inertních stacionárních fází a integrace s vysokorychlostními MS systémy přinese vyšší průchodnost a automatizaci, což je klíčové pro QA/QC v biofarmaceutickém sektoru.
HILIC a HIC představují cenné doplňky k RPLC pro analýzu polárních sloučenin i proteinů. Správná volba kolony a optimalizace mobilní fáze přináší vyšší selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost, což umožňuje robustní charakterizaci od malých metabolitů až po složité bioterapeutika.
Agilent application notes 5991-9271EN, 5994-5949EN, 5994-0199EN
HPLC
ZaměřeníVýrobceAgilent Technologies
Souhrn
Význam tématu
Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a chromatografie na bázi hydrofilních interakcí (HILIC) představují doplňující režimy k běžné reverzní fázi (RPLC). HILIC umožňuje spolehlivou retenci velmi polárních a ionizovatelných látek, zatímco HIC zajišťuje separaci proteinů v jejich nativní formě bez denaturace.
Cíle a přehled studie
Článek shrnuje teoretické principy HILIC a HIC, popisuje vývoj metodik a strategie optimalizace. Ukazuje výběr vhodných kolon, mobilních fází a gradientních protokolů pro široké spektrum analytů od aminokyselin a cukerných struktur až po monoklonální protilátky.
Použitá metodika a instrumentace
Metodika HILIC staví na adsorpci vodného filmu na polární povrch a rozdělení na základě polarity a iontově-výměnných interakcí. HIC využívá vysokou koncentraci soli k potlačení elektrostatických účinků a eluci proteinů postupným snižováním iontového sílení. K měření se používají bio-inertní LC systémy Agilent, kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC a AdvanceBio HIC, detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD a hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ a Ultivo LC/TQ.
Hlavní výsledky a diskuse
V HILIC režimu se eluce řídí obráceně oproti RPLC a dosahuje se lepší separace izobarických a vysoce polárních sloučenin. Úprava podílu akrylonitrilu, pH a pufrovací soli dramaticky mění retenci i selektivitu. AdvanceBio HIC kolony umožňují detailní analýzu intact mAb, jejich fragmentů, posttranslačních modifikací, oxidovaných variant a DAR u ADC. Online 2D-LC/MS spojení HIC a RP eliminuje problémy se solí a zjednodušuje identifikaci neznámých složek.
Přínosy a praktické využití metody
- HILIC rozšiřuje schopnost RPLC analyzovat silně polární a ionizované látky, včetně glykanů.
- HIC zachovává nativní konformaci proteinů a podporuje analýzu kritických kvality atributů monoklonálních protilátek.
- Bio-inertní a MS-kompatibilní kolony a mobilní fáze zvyšují citlivost, reprodukovatelnost a robustnost analýz.
Budoucí trendy a možnosti využití
Propojení HILIC a HIC v multidimenzionálních platformách 2D-LC nabídne komplexní pohled na extrémně složité vzorky. Vývoj nových bio-inertních stacionárních fází a integrace s vysokorychlostními MS systémy přinese vyšší průchodnost a automatizaci, což je klíčové pro QA/QC v biofarmaceutickém sektoru.
Závěr
HILIC a HIC představují cenné doplňky k RPLC pro analýzu polárních sloučenin i proteinů. Správná volba kolony a optimalizace mobilní fáze přináší vyšší selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost, což umožňuje robustní charakterizaci od malých metabolitů až po složité bioterapeutika.
Použitá instrumentace
- Agilent InfinityLab bio-inertní LC systémy s PEEK-flowpath
- Kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC, AdvanceBio HIC
- Detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD
- Hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ, Ultivo LC/TQ
Reference
Agilent application notes 5991-9271EN, 5994-5949EN, 5994-0199EN
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
HILIC Chromatography: When and How?
2022|Agilent Technologies|Prezentace
HILIC Chromatography: When and How? Golnar Javadi Applications Engineer LC Columns and Consumables Technical Support January 25, 2022 Agenda 1 What is HILIC and when should you consider it? 2 HILIC method development • • 3 Tips and tricks for…
Klíčová slova
hilic, hilicyes, yesmobile, mobileinfinitylab, infinitylabphase, phaseyour, yourcolumn, columnconsider, considerrplc, rplcsolubility, solubilitybest, bestwhen, whensolvent, solventanalytes, analytesretain
Thinking Outside the C18 Box
2018|Agilent Technologies|Prezentace
Thinking Outside the C18 Box 1 Modes of HPLC • Reversed-phase • C18, C8, other non-polar phases • Phenyl, PFP, other more polar phases • Ion Pairing • HILIC • Silica • Amide • Zwitterionic • Hydroxyl-based • Chiral •…
Klíčová slova
hilic, hilicpolar, polarporoshell, poroshellvitamins, vitaminsphase, phasephases, phasesbest, bestsoluble, solublemobile, mobileconfidentiality, confidentialitychiral, chiralpair, pairstatement, statemention, ionwater
Making the Leap - Small Molecule – Biologics
2020|Agilent Technologies|Prezentace
Making the Leap Small Molecule – Biologics Rita Steed LC Columns Application Engineer May 8, 2019 1 May 8, 2019 Small molecule – Biologics Agilent Restricted Outline • Small and/or biomolecules; similarities/differences • Column choice • Things to consider •…
Klíčová slova
biologics, biologicsrestricted, restrictedmolecule, moleculesmall, smallagilent, agilentporoshell, poroshellinfinitylab, infinitylabadvancebio, advancebiodiffusion, diffusionsize, sizemab, mabphase, phasedeemter, deemtermau, mauvan
There is More to HPLC Than Reverse Phase - Column choices: Have you thought about the rest?
2019|Agilent Technologies|Prezentace
There is More to HPLC Than Reverse Phase Column choices: Have you thought about the rest? Jean Lane Application Engineer December 12, 2019 DE.3031944444 Agilent Restricted Why Not to Use Reverse Phase Some reasons for trying an alternative C18 columns…
Klíčová slova
restricted, restrictedchiral, chiralagilent, agilentmonolith, monolithbio, bioporoshell, poroshellhic, hiciex, iexprotein, proteinphase, phaseadvancebio, advancebioaffinity, affinityzorbax, zorbaxexchange, exchangeinteractions
