Why Use HILIC and HIC Chromatography?
Prezentace | 2024 | Agilent TechnologiesInstrumentace
Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a chromatografie na bázi hydrofilních interakcí (HILIC) představují doplňující režimy k běžné reverzní fázi (RPLC). HILIC umožňuje spolehlivou retenci velmi polárních a ionizovatelných látek, zatímco HIC zajišťuje separaci proteinů v jejich nativní formě bez denaturace.
Článek shrnuje teoretické principy HILIC a HIC, popisuje vývoj metodik a strategie optimalizace. Ukazuje výběr vhodných kolon, mobilních fází a gradientních protokolů pro široké spektrum analytů od aminokyselin a cukerných struktur až po monoklonální protilátky.
Metodika HILIC staví na adsorpci vodného filmu na polární povrch a rozdělení na základě polarity a iontově-výměnných interakcí. HIC využívá vysokou koncentraci soli k potlačení elektrostatických účinků a eluci proteinů postupným snižováním iontového sílení. K měření se používají bio-inertní LC systémy Agilent, kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC a AdvanceBio HIC, detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD a hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ a Ultivo LC/TQ.
V HILIC režimu se eluce řídí obráceně oproti RPLC a dosahuje se lepší separace izobarických a vysoce polárních sloučenin. Úprava podílu akrylonitrilu, pH a pufrovací soli dramaticky mění retenci i selektivitu. AdvanceBio HIC kolony umožňují detailní analýzu intact mAb, jejich fragmentů, posttranslačních modifikací, oxidovaných variant a DAR u ADC. Online 2D-LC/MS spojení HIC a RP eliminuje problémy se solí a zjednodušuje identifikaci neznámých složek.
Propojení HILIC a HIC v multidimenzionálních platformách 2D-LC nabídne komplexní pohled na extrémně složité vzorky. Vývoj nových bio-inertních stacionárních fází a integrace s vysokorychlostními MS systémy přinese vyšší průchodnost a automatizaci, což je klíčové pro QA/QC v biofarmaceutickém sektoru.
HILIC a HIC představují cenné doplňky k RPLC pro analýzu polárních sloučenin i proteinů. Správná volba kolony a optimalizace mobilní fáze přináší vyšší selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost, což umožňuje robustní charakterizaci od malých metabolitů až po složité bioterapeutika.
Agilent application notes 5991-9271EN, 5994-5949EN, 5994-0199EN
HPLC
ZaměřeníVýrobceAgilent Technologies
Souhrn
Význam tématu
Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a chromatografie na bázi hydrofilních interakcí (HILIC) představují doplňující režimy k běžné reverzní fázi (RPLC). HILIC umožňuje spolehlivou retenci velmi polárních a ionizovatelných látek, zatímco HIC zajišťuje separaci proteinů v jejich nativní formě bez denaturace.
Cíle a přehled studie
Článek shrnuje teoretické principy HILIC a HIC, popisuje vývoj metodik a strategie optimalizace. Ukazuje výběr vhodných kolon, mobilních fází a gradientních protokolů pro široké spektrum analytů od aminokyselin a cukerných struktur až po monoklonální protilátky.
Použitá metodika a instrumentace
Metodika HILIC staví na adsorpci vodného filmu na polární povrch a rozdělení na základě polarity a iontově-výměnných interakcí. HIC využívá vysokou koncentraci soli k potlačení elektrostatických účinků a eluci proteinů postupným snižováním iontového sílení. K měření se používají bio-inertní LC systémy Agilent, kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC a AdvanceBio HIC, detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD a hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ a Ultivo LC/TQ.
Hlavní výsledky a diskuse
V HILIC režimu se eluce řídí obráceně oproti RPLC a dosahuje se lepší separace izobarických a vysoce polárních sloučenin. Úprava podílu akrylonitrilu, pH a pufrovací soli dramaticky mění retenci i selektivitu. AdvanceBio HIC kolony umožňují detailní analýzu intact mAb, jejich fragmentů, posttranslačních modifikací, oxidovaných variant a DAR u ADC. Online 2D-LC/MS spojení HIC a RP eliminuje problémy se solí a zjednodušuje identifikaci neznámých složek.
Přínosy a praktické využití metody
- HILIC rozšiřuje schopnost RPLC analyzovat silně polární a ionizované látky, včetně glykanů.
- HIC zachovává nativní konformaci proteinů a podporuje analýzu kritických kvality atributů monoklonálních protilátek.
- Bio-inertní a MS-kompatibilní kolony a mobilní fáze zvyšují citlivost, reprodukovatelnost a robustnost analýz.
Budoucí trendy a možnosti využití
Propojení HILIC a HIC v multidimenzionálních platformách 2D-LC nabídne komplexní pohled na extrémně složité vzorky. Vývoj nových bio-inertních stacionárních fází a integrace s vysokorychlostními MS systémy přinese vyšší průchodnost a automatizaci, což je klíčové pro QA/QC v biofarmaceutickém sektoru.
Závěr
HILIC a HIC představují cenné doplňky k RPLC pro analýzu polárních sloučenin i proteinů. Správná volba kolony a optimalizace mobilní fáze přináší vyšší selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost, což umožňuje robustní charakterizaci od malých metabolitů až po složité bioterapeutika.
Použitá instrumentace
- Agilent InfinityLab bio-inertní LC systémy s PEEK-flowpath
- Kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC, AdvanceBio HIC
- Detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD
- Hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ, Ultivo LC/TQ
Reference
Agilent application notes 5991-9271EN, 5994-5949EN, 5994-0199EN
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
HILIC Chromatography: When and How?
2022|Agilent Technologies|Prezentace
HILIC Chromatography: When and How? Golnar Javadi Applications Engineer LC Columns and Consumables Technical Support January 25, 2022 Agenda 1 What is HILIC and when should you consider it? 2 HILIC method development • • 3 Tips and tricks for…
Klíčová slova
hilic, hilicyes, yesmobile, mobileinfinitylab, infinitylabphase, phaseyour, yourcolumn, columnconsider, considerrplc, rplcsolubility, solubilitybest, bestwhen, whensolvent, solventanalytes, analytesretain
Thinking Outside the C18 Box
2018|Agilent Technologies|Prezentace
Thinking Outside the C18 Box 1 Modes of HPLC • Reversed-phase • C18, C8, other non-polar phases • Phenyl, PFP, other more polar phases • Ion Pairing • HILIC • Silica • Amide • Zwitterionic • Hydroxyl-based • Chiral •…
Klíčová slova
hilic, hilicpolar, polarporoshell, poroshellvitamins, vitaminsphase, phasephases, phasesbest, bestsoluble, solublemobile, mobileconfidentiality, confidentialitychiral, chiralpair, pairstatement, statemention, ionwater
Making the Leap - Small Molecule – Biologics
2020|Agilent Technologies|Prezentace
Making the Leap Small Molecule – Biologics Rita Steed LC Columns Application Engineer May 8, 2019 1 May 8, 2019 Small molecule – Biologics Agilent Restricted Outline • Small and/or biomolecules; similarities/differences • Column choice • Things to consider •…
Klíčová slova
biologics, biologicsrestricted, restrictedmolecule, moleculesmall, smallagilent, agilentporoshell, poroshellinfinitylab, infinitylabadvancebio, advancebiodiffusion, diffusionsize, sizemab, mabphase, phasedeemter, deemtermau, mauvan
A Look at Column Choices
2015|Agilent Technologies|Prezentace
A Look at Column Choices Mark Powell Applications Engineer Columns and Supplies Technical Support Confidentiality Label April 8, 2015 1 Overview What to consider when choosing a column? • Column chemistry • Silica surface • Bonded phase • End-capping •…
Klíčová slova
confidential, confidentialconfidentiality, confidentialitybonded, bondedmau, mauparticle, particleagilent, agilentporous, porousphase, phaselabel, labelsize, sizeselectivity, selectivitychange, changediffusion, diffusiontotally, totallymin
