Evaluation of a rapid LC-MS/MS method to measure simultaneously IDUA and IDS enzymes activities in dried blood spots

Význam tématu

Screening novorozenců na mukopolysacharidózy (MPS I a II) vyžaduje rychlé a spolehlivé metody stanovení aktivity lysozomálních enzymů. Včasná detekce deficitu enzymů IDUA a IDS umožňuje zahájit léčbu v kritickém okně vývoje dítěte a výrazně zlepšit klinický prognózu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou LC-MS/MS metodu umožňující současné stanovení aktivity IDUA (MPS I) a IDS (MPS II) v sušených krevních skvrnách (DBS). Porovnaly se konvenční 6minutová a ultrarychlá 2minutová chromatografická separace, přičemž obě verze byly hodnoceny z hlediska korelace a schopnosti odlišit pacienty s MPS od zdravých jedinců.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků se z DBS disků (3 mm) extrahoval enzymatický substrát v inkubačním pufru při 37 °C po dobu 16 h. Po zastavení reakce následovala extrakce a chromatografická analýza.

• UHPLC systém Nexera MP se spektrometrem LCMS-8050 (Shimadzu).
• Kolony Phenomenex Kinetex XB-C18 150 × 2,1 mm, 1,7 µm (6 min) a 30 × 2,1 mm, 1,7 µm (2 min).
• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % kyseliny formiové, B: acetonitril + 0,1 % kyseliny formiové.
• MRM režim, ionizace ESI pozitivní; přechody pro IDUA a IDS i jejich deuterované interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě chromatografické verze prokázaly vynikající korelaci aktivity enzymů (6 min vs. 2 min: R = 0,9959 pro MPS I, R = 0,9909 pro MPS II). Ultrarychlý 2minutový běh umožnil jasné rozlišení mezi zdravými novorozenci a pacienty s MPS II díky výrazně nižší naměřené aktivitě IDS u postižených.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí významné zkrácení doby analýzy při zachování přesnosti a citlivosti. Umožňuje high-throughput screening v novorozeneckých programech a potenciálně multiplexní rozšíření na další lysozomální enzymy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další optimalizace doby analýzy pod 2 minuty, rozšíření panelu enzymů pro komplexní screening lysozomálních onemocnění a integrace do plně automatizovaných linek pro preventivní diagnostiku.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro simultánní stanovení aktivit IDUA a IDS v DBS je rychlá, spolehlivá a vhodná pro novorozenecký screening MPS I a MPS II. Ultrarychlý 2minutový protokol vykazoval srovnatelnou výkonnost s konvenčním 6minutovým během a přináší nezbytný časový benefit pro high-throughput analýzu.

Reference

• Liu Y et al. Clin Chem. 2017, 63(6):1118-1126.
• Tanaka M. et al. ThP039, AMED project, Shimadzu Corporation, 2023.