Comparison of FIA and on-column LC-MS/MS method to measure simultaneously ABG, ASM, GAA, GALC, GLA and IDUA activities

Význam tématu

Analýza aktivity lyzosomálních enzymů je klíčová pro včasný screening dědičných lysozomálních chorob u novorozenců. Multiplexní měření šesti enzymů v suchých kapkách krve (DBS) usnadňuje diagnostiku onemocnění, jako je Gaucherova, Fabryho a Pompeho choroba, a přispívá k rychlému zahájení léčby.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo srovnat dva přístupy k LC-MS/MS analýze šesti enzymových aktivit (ABG, ASM, GAA, GALC, GLA, IDUA): rychlou FIA-MS/MS (flow injection analysis) a klasickou on-column chromatografii. Studie hodnotila přesnost, opakovatelnost, míru pozadí a schopnost rozlišit prázdný vzorek od normálního.

Použitá metodika

Pro všechny analýzy byl použit 6-plex NeoLSD kit (PerkinElmer) obsahující substráty a deuterované interní standardy. Z DBS byly vyseknuty 3,2mm disky, inkubovány s reakcním pufrem 16–20 h. FIA i on-column metody spalovaly stejný extrakt, lišily se pouze chromatografickou separací.

Použitá instrumentace

• UHPLC Nexera MP spojené s triple kvadrupólovým hmotovým spektrometrem LCMS-8050 (Shimadzu)
• Kolony GL Sciences MonoTower C18 (2×50 mm, 3 µm)
• Mobilní fáze: voda a acetonitril, každý obsahoval 0,1 % kyseliny mravenčí
• FIA: izokratický průtok 0,3 mL/min, 84 % organiky, injekce 10 µL
• On-column: gradient 75–100 % organiky, průtok 0,2 mL/min, injekce 1 µL
• Ionizace ESI v pozitivním módu, MRM sledování (přechody pro IS, produkty a substráty)

Hlavní výsledky a diskuse

• FIA-MS/MS poskytla vysokou propustnost, ale v prázdném vzorku vykazovala významné šumy u ABG, GALC a GLA v produktu, pravděpodobně kvůli in-source fragmentaci substrátů.
• On-column separace odstranila interferenční signály oddělením substrátu od produktu, čímž zlepšila selektivitu a přesnost měření.
• U ASM byla zjištěna interferenční špička, pravděpodobně související s fragmentací GALC sloučenin.
• Rozlišení normálního a blank vzorku bylo jasnější v on-column módu, což potvrzuje vhodnost chromatografické separace pro validaci screeningových metod.

Přínosy a praktické využití metody

• FIA umožňuje rychlou předselekci velkého počtu vzorků, zejména v poplachových scénářích.
• On-column LC-MS/MS je vhodná pro konečnou validaci a kvantifikaci aktivity enzymů s minimem falešně pozitivních signálů.
• Multiplexní přístup šetří materiál a reagencie, což snižuje náklady na screening.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace chromatografických podmínek a rychlejší UHPLC kolony pro zvýšení propustnosti.
• Integrace s automatizovanými systémy pro plně robotizovaný screening.
• Využití vysokorozlišovací MS nebo MRM³ ke zpřesnění detekce nízko abundantních produktů.
• Rozšíření panelu enzymů o další lyzosomální a peroxozomální aktivity.

Závěr

On-column LC-MS/MS ukázala v porovnání s FIA lepší selektivitu a přesnost měření šesti lyzosomálních enzymů v DBS. Přestože FIA nabízí vyšší throughput, pro spolehlivý screening novorozeneckých vzorků je vhodné využít chromatografické oddělení k potlačení interferencí.

Reference

• Tanaka M. et al., ASMS 2017, ThP 091
• 6-plex NeoLSD assay kit (PerkinElmer Inc.)
• Shimadzu Corporation, Nexera MP a LCMS-8050 Instrument Manuals